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細胞内および動物組織におけるαBクリスタリンのリン酸化の生理的意義の解明

阐明细胞和动物组织中 αB 晶状体蛋白磷酸化的生理意义

基本信息

批准号：
11771465
负责人：
伊東秀記
金额：
$ 1.09万
依托单位：
Institute for Developmental Research, Aichi Human Service Center
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
财政年份：
1999
资助国家：
日本
起止时间：
1999 至 2000
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-11771465/
关键词：
ストレス蛋白質 αBクリスタリンリン酸化クリスタリン

项目摘要

今年度は、αBクリスタリンのリン酸化が持つ生理的な役割を明らかにすることを目的として、ヒトαBクリスタリンの野生型(wt-αB)および3カ所のリン酸化部位(Ser19,Ser45,Ser59)をアスパラギン酸残基に置換したリン酸化擬似変異体(3D-αB)のリコンビナント蛋白質を大腸菌に大量発現させた後に精製し、種々の蛋白質化学的な解析を行った。両蛋白質のCDスペクトルを測定したところ、far UVCDスペクトルは、両蛋白質共にβ-sheet構造を多く含むと推測されるスペクトルを示し、明らかな差は観察されなかった。このことから、wt-αBと3D-αBとでは、顕著な二次構造の変化は起こっていないことが示唆された。一方、near UVCDスペクトルは有意に異なっており、変異導入によって三次構造の変化が起こっていることが示唆された。この結果は、蛍光スペクトルの測定によっても確認することができた。また、温度上昇に伴うfar UVCDスペクトルの変化を調べると、wt-αBよりも3D-αBの変化が大きいことがわかった。さらに、両蛋白質の疎水性をANS binding assayにより比較したところ、3D-αBは疎水性が低下していることがわかった。ショ糖密度勾配遠心法によって重合状態を調べたところ、3D-αBはwt-αBに比べて低分子量側に検出された。ゲルろ過法によってみかけの分子量を調べたところwt-αBは約550kDaの、3D-αBは約390kDaの重合体を作っていることがわかった。また、両蛋白質の分子シャペロン活性を蛋白質の凝集抑制作用、およびルシフェラーゼの活性回復で調べたところ、3D-αBはwt-αBよりもシャペロン活性が低下していることがわかった。

This year, αB species are isolated from the wild type (wt-αB) and 3 species are isolated from the wild type (wt-αB).(Ser19,Ser45,Ser59) is a protein that is produced in large quantities in E. coli, purified, and analyzed chemically in species. The protein content of CD was measured and the protein content of β-sheet was estimated. 3D-αB One side, near UVCD, two sides, three sides The results of this study are as follows: The temperature rise is accompanied by a change in the temperature of the far UVCD, wt-αB and 3D-αB. The protein binding assay was conducted in the presence of 3D-αB and the protein binding assay was conducted in the presence of 3D-αB. The sugar density is matched with the remote center, and the 3D-αB is matched with the low molecular weight side. The molecular weight of 3D-αB is about 550kDa, and that of 3D-αB is about 390kDa. Protein aggregation inhibition, protein aggregation, protein aggregation, protein aggregation.