水痘帯状疱疹ウイルス次世代ワクチン開発の基礎的研究

开发下一代水痘带状疱疹病毒疫苗的基础研究

• 批准号: 15790603
• 负责人: 伊東 秀記
• 金额: $ 2.3万
• 依托单位: Jikei University School of Medicine
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
• 财政年份: 2003
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2003 至 2004
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-15790603/
• 关键词: VZV; 水痘-帯状疱疹ウイルス; ORF29; Cosmid

組織培養下でウイルスの複製および増殖に関する役割が不明な水痘-帯状疱疹ウイルス遺伝子-ORF29について、その遺伝子機能について検討している。組み替え操作の容易化のためスタンフォード大学のグループにより作成された、コスミドベクター、Fsp4(VZV:1-33211),Spe5(21875-40134),Pme19(53877-96188),Spe5(94208-124884)のうち、Spe5のORF29がコードされている部分を制限酵素NheIで制限酵素処理し、gel isolationにより12.5kbの断片を抽出した。また、プラスミドベクターであるbBR322を同様に、制限酵素NheIで制限酵素処理し、self ligationを防ぐためCIP処理後、Spe5から分離した12.5kbの遺伝子断片を制限酵素NheI部位に挿入した。挿入遺伝子の方向に関しては、制限酵素の切断パターンにて確認した。このようにして得られた、約16.5kbのサブクローニングベクターからVZV ORFP29を欠損させるため、平滑末端を作成する目的で、pfu-Polymeraseを用いたPCRにて、スタートコドンおよびストップコドンの前後に制限酵素NotIサイトを含んだプライマーを設計し、PCRによりスタートコドンの5'方向およびストップコドンの3'方向をPCRにて増幅しサイズを確認後、精製し、これらのPCR産物を確認するために、さらにこれらのPCR産物をTopo cloning vectorに挿入し、シークエンスにて確認した。適切な遺伝子配列を確認後、PCR産物は制限酵素NotIで制限酵素処理を行い、また、サブクローニングベクターもNotIで制限酵素処理を行い、これら、2つのPCR産物をTriple ligationにてサブクローニングベクターに組み込みなおしている過程である。

In tissue culture, it is necessary to investigate the replication and propagation of chicken pox, herpes zoster and its gene ORF29. For ease of operation of the group, the ORF 29 of Spe 5 was restricted to the middle part of NheI, which limited the processing fragment and gel isolation to 12.5kb, and the enzyme was extracted from Fsp4 (VZV: 1 - 33211), Spe 5 (21875 - 40134), Pme 19 (53877 - 96188), Spe 5 (94208 - 124884). BBR322 is the same as the restriction enzyme NheI and self ligation. After CIP treatment, Spe 5 is isolated and the 12.5kb gene fragment is inserted into the restriction enzyme NheI site. The direction of the input signal is related to the identification of the control enzyme and the cut-off signal For this purpose, a 16.5kb fragment of pfu-polymerase was designed for PCR, PCR, and restriction enzymes before and after the production of VZV ORFP 29. PCR amplification in 5 'direction and PCR amplification in 3' direction, purification, PCR product confirmation, PCR product confirmation in Topo cloning vector After the sequence of the appropriate gene is confirmed, the PCR product is processed by restriction enzyme NotI, restriction enzyme NotI, restriction enzyme, restriction enzyme No