2光子励起ケイジド試薬を用いたグルタミン酸受容体機能分布とカルシウム動態の可視化

使用双光子激发笼式试剂可视化谷氨酸受体功能分布和钙动力学

• 批准号: 15700309
• 负责人: 松崎 政紀
• 金额: $ 2.24万
• 依托单位: National Institute for Physiological Sciences (2004)Okazaki National Research Institutes (2003)
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
• 财政年份: 2003
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2003 至 2004
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-15700309/
• 关键词: 中枢神経細胞; 神経生理学; 超短パルスレーザー; ケイジド試薬; グルタミン酸; 受容体; 生理学; 2光子励起顕微鏡; スパイン; 高性能レーザー; カルシウム; イメージング

これまでケイジドグルタミン酸を2光子励起法で活性化する手法により、海馬錐体細胞において、機能的AMPA受容体発現とスパイン形態に強い相関があることを見出してきた。そこで本研究において、可塑性に重要な役割を果たすNMDA受容体の機能と、スパイン形態との間の関係性を調べることを行った。実験方法としては、海馬錐体細胞にホールセルを行い、低親和性カルシウム指示薬と、細胞形態を同定するためのAlexa594をロードした。これはカルシウム指示薬によるカルシウム動態の影響を少なくするためである。細胞外液のマグネシウム濃度を減らした状態で、任意のスパイン部位に対して、2光子励起によってケイジドグルタミン酸を活性化した。その結果誘発される単一スパインにおけるNMDA受容体を介したカルシウム濃度上昇を、2光子励起顕微鏡を用いて、高速ラインスキャンを行ってイメージングした。Alxa594の蛍光に対するカルシウム指示薬の蛍光比によってカルシウム濃度変化を捉えた。この方法によって、一定刺激の条件でのスパイン内カルシウム濃度変化の絶対値を求めることができるようになった。カルシウム濃度上昇は、レーザー出力の2乗に比例し、あるところで飽和することから、スパイン頭部のNMDA受容体を2光子励起法によるグルタミン酸投与によって刺激できることを実証した。また1.5マイクロメートル以上離れたスパイン間では互いに刺激が干渉せず、個々のスパインだけの反応を得られることがわかった。NMDA受容体電流及びカルシウム濃度上昇は、AMPA受容体に比べ、ノイズが高いため、同一スパインにおいて3回刺激し、それを平均化することでCVの低い値を得ることができた。

こ れ ま で ケ イ ジ ド グ ル タ ミ ン acid を two photon excitation up で activeness す る gimmick に よ り, hippocampal pyramidal cells に お い て, functional AMPA let body 発 now と ス パ イ ン form strong に い phase masato が あ る こ と を shows し て き た. そ こ で this study に お い て important な "を cut fruit, plasticity に た す NMDA と の let body function, ス パ イ と ン form between の の masato is sexual を adjustable べ る こ と を line っ た. Be 験 method と し て は, hippocampal pyramidal cells に ホ ー ル セ ル を い, low affinity カ ル シ ウ ム instructions 薬 と, cell morphology を be す る た め の Alexa594 を ロ ー ド し た. <s:1> れ カ カ シウム シウム シウム indicates that the によるカ シウム シウム シウム has a dynamic <s:1> impact を is less なくするためである. Extracellular fluid の マ グ ネ シ ウ を ム concentration reduction ら し た state で, arbitrary の ス パ イ ン parts に し seaborne て, two photon excitation に よ っ て ケ イ ジ ド グ ル タ ミ ン acid を activeness し た. そ の results induced 発 さ れ る 単 a ス パ イ ン に お け る NMDA を interface by let body し た カ ル シ ウ ム concentration rising を, two photon excitation 顕 micromirror を with い て, high-speed ラ イ ン ス キ ャ ン を line っ て イ メ ー ジ ン グ し た. Alxa594 の 蛍 light に す seaborne る カ ル シ ウ ム instructions 薬 の 蛍 light than に よ っ て カ ル シ ウ ム concentration variations change を catch え た. こ の way に よ っ て conditions, certain stimulation の で の ス パ イ ン within カ ル シ ウ ム patches.by concentration variations の unique numerical を seaborne め る こ と が で き る よ う に な っ た. Rise of カ ル シ ウ ム は, レ ー ザ ー output の 2 乗 に proportion し, あ る と こ ろ saturated で す る こ と か ら, ス パ イ ン head の NMDA を two photon excitation by let bodies method に よ る グ ル タ ミ ン cast with acid に よ っ て stimulus で き る こ と を card be し た. ま た 1.5 マ イ ク ロ メ ー ト ル above from れ た ス パ イ ン between で は mutual い に stimulus が dry involved せ ず, a 々 の ス パ イ ン だ け の anti 応 を must ら れ る こ と が わ か っ た. NMDA by current capacity and び カ ル シ ウ ム concentration rising は, AMPA, let body に than べ, ノ イ ズ が high い た め, same ス パ イ ン に お い て 3 back to stimulate し, そ れ を averageness す る こ と で CV on low の い numerical を must る こ と が で き た.

项目成果

Propagation of gammaPKC translocation along the dendrites of Purkinje cell in γPKC-GFP transgenic mice

γPKC-GFP转基因小鼠中γPKC易位沿浦肯野细胞树突的传播

• 发表时间: 2004
• 期刊: Genes to Cells 9
• 作者: Tanaka J. et al.;Sakai N. et al.
• 通讯作者: Sakai N. et al.

Kasai, H., Matsuzaki, M, Ellis-Davies, G.C.R.: "Two-photon uncaging microscopy. In "Imaging in Neuroscience and Development,""CSH Lab. Press(In press). (2004)

Kasai, H.、Matsuzaki, M、Ellis-Davies, G.C.R.：“双光子解笼显微镜。在“神经科学与发展中的成像”中，”CSH 实验室。

Structural basis of long-term potentiation in single dendritic spines

• DOI: 10.1038/nature02617
• 发表时间: 2004-06-17
• 期刊: NATURE
• 影响因子: 64.8
• 作者: Matsuzaki, M;Honkura, N;Kasai, H
• 通讯作者: Kasai, H

Kasai, H., Matsuzaki, M., Noguchi, J., Yasumatsu, N., Nakahara, H.: "Structure-stability-function relationships of dendritic spines."Trends in Neurosciences. 26. 360-368 (2003)

Kasai, H.、Matsuzaki, M.、Noguchi, J.、Yasumatsu, N.、Nakahara, H.：“树突棘的结构-稳定性-功能关系。”神经科学趋势。

Number and density of AMPA receptors in single synapses in immature cerebellum

• DOI: 10.1523/jneurosci.4256-04.2005
• 发表时间: 2005-01-26
• 期刊: JOURNAL OF NEUROSCIENCE
• 影响因子: 5.3
• 作者: Tanaka, J;Matsuzaki, M;Shigemoto, R
• 通讯作者: Shigemoto, R