QT延長症候群関連変異イオンチャネル蛋白のプロセッシング異常のメカニズムの解明

阐明与长QT综合征相关的突变离子通道蛋白异常加工机制

• 批准号: 16790193
• 负责人: 神吉 秀明
• 金额: $ 1.92万
• 依托单位: Keio University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
• 财政年份: 2004
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2004 至 2005
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-16790193/
• 关键词: QT延長症候群; KCNQ1; 免疫細胞化学; 蛋白細胞内輸送; 細胞膜算出; 遺伝子異常

我々は正常チャネル蛋白および異常チャネル蛋白の細胞内局在を検証するためにKCNQ1蛋白とGFPとのfusion蛋白(C末端にGFP)を作成した。これにより細胞内局在をaliveの状態で観察できることになる。我々はHEK293細胞に野生型あるいは変異型KCNQ1チャネル蛋白のcDNAを導入し観察を行っている。また、このKCNQ1の細胞外ループにはc-mycエピトープが挿入されているため、細胞膜透過性を上げない状態で免疫細胞染色することにより細胞膜表面に到達したチャネル蛋白のみを検知することができる。膜輸送の有無を検証する実験系において、膜表出がない場合に変異蛋白が合成後速やかに処理・破壊されてしまっているのか、それとも蛋白合成されるもののER-Golgiレベルで停留しているのかを明らかにする必要がある。我々の実験系ではGFPと相互に干渉しない蛍光色素(PEなど)を使用することにより、細胞内で合成された蛋白(GFP:緑色)のうち膜表面に到達した蛋白(GFPとPEでラベル)を共焦点レーザー顕微鏡を用いて観察することができる。さらに、より客観性のある検証方法としてフローサイトメトリーを使用し膜表出蛋白を定量化する試みを行っている。我々は、これまで報告のあったQT延長症候群関連変異のうち、細胞膜への輸送障害が原因と強く疑われているものから検証を行うことにした。我々の検証においても、QT延長症候群関連変異KCNQ1 T587Mは膜表出が認められないものの細胞内部での合成はなされていることが確認され、細胞内輸送異常がその疾病の本体であることが判明した。今後順次QT延長症候群関連変異の検証を行い、この疾病のメカニズムに迫るよう研究を進めてゆく予定である。

I have produced a normal チャネル protein and an abnormal チャネル protein in the intracellular localization of the KCNQ1 protein and GFP fusion protein (C-terminal GFP).これによりThe internal state of the cell is in the をalive state. I introduced wild-type HEK293 cells into heterogeneous KCNQ1 protein cDNA and introduced it into the wild-type HEK293 cells.また、このKCNQ1の extracellular ループにはc-mycエピトープがinsert されているため、cell membrane permeability をげないstateでimmune cell stainingすることによりThe surface of the cell membraneにreaches the protein of the のみを検知することができる. The presence or absence of membrane transport, the detection of membrane transport, the membrane expression, the situation of heterogeneous protein, the post-synthesis speed, processing and destruction of membraneいるのか, それともprotein synthesis されるもののER-Golgi レベルでstay しているのかを明らかにするNecessary がある. Our 々の実験system ではGFPと mutual に干渉しない蛍photopigment (PEなど)を uses することにより, and the でsynthetic されたprotein (GF P: Green) The protein (GFP, PE, でラベル) reached the surface of the membrane and was inspected using a confocal microscope.さらに, より客榳性のある検 Method of verification, としてフローサイトメトリーを, using しmembrane to express protein, quantification of するtest, みを行っている. My 々は、これまでreportのあったQT prolongation syndrome-related 剉differentのうち、Cell membrane The cause of the transportation obstruction is the strong suspicion and the suspicion. My 々の検 Syndrome においても、QT prolongation syndrome related difference KCNQ1 T587M membrane surface recognition and synthesis inside the cellことがConfirmationされ、Intracellular transport abnormalityがそのThe main body of the diseaseであることがIdentificationした. From now on, the QT prolongation syndrome-related changes in the relationship between the syndrome and the disease will be investigated and determined.