超極細探針による低侵襲細胞免疫技術の開発

使用超细探针开发微创细胞免疫技术

• 批准号: 16686047
• 负责人: 中村 史
• 金额: $ 18.05万
• 依托单位: National Institute of Advanced Industrial Science and Technology
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Young Scientists (A)
• 财政年份: 2004
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2004 至 2006
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-16686047/
• 关键词: AFM; 細胞操作; 抗体; 力学測定; 挿入; 相互作用; 細胞骨格蛋白質; ナノニードル; 細胞骨格タンパク質

既存の細胞内蛋白質解析技術として免疫染色、GFP融合蛋白質の発現、フローサイトメトリーなどの手法が存在する。これらの手法は、生きたまま細胞を解析出来ない、あるいは細胞内部の蛋白質を解析出来ないという問題点がある。本研究では細胞内の骨格蛋白質を力学的に検出する手法を開発した。骨格蛋白質としてはアクチンを標的蛋白質として、抗アクチン抗体を固定化したナノ針を細胞に挿入・抜去する際の抗原抗体相互作用の破壊に要した力(unbinding force)を観察することで生細胞内のアクチン繊維の構造や分布を力学的に評価した。AFM探針を集束イオンビームにより加工し、直径約200nm、長さ約10μmのナノ針を作製した。抗アクチン抗体は化学修飾によりナノ針表面に固定化し、細胞に抗体固定化ナノ針を挿入・抜去し、フォースカーブから力学応答を観察した。繊維状構造の解析にはメラノサイトを用い、脱重合剤サイトカラシンDを用い細胞内の繊維状アクチンの脱重合過程を解析した。分布解析においてはGFP融合βアクチンを発現させた平滑筋細胞に対し、ストレスファイバーの分布を蛍光観察した後、500nm間隔で19×19点でフォースカーブ解析を行った。繊維状構造の解析では、脱重合状態を蛍光標識ファロイジンによる蛍光染色とunbinding force測定によって評価した。両者とも経時的に減少する様子が観察され、繊維状構造が破壊された場合はunbinding forceがゼロになることが分かった。これによりunbinding forceの大きさによって生細胞内の構造体として機能する繊維状アクチンを特異的に検出する方法として有用であることが示された。また、分布解析においては、ストレスファイバーの位置と1nN以上の大きいunbinding forceが検出された位置に相関性が見られ、生きた細胞内部の骨格蛋白質の分布を観察出来ることが示唆された。

Existing intracellular protein analysis technologies such as immunostaining, GFP fusion protein development, and FiberTechnology techniques also exist.これらのtechniqueは、生きたままThe cells are analyzedない、あるいはThe proteins inside the cells are analyzedないというThe problem is solvedがある. This study is based on the method of developing the mechanics of intracellular bone proteins. Bone lattice protein としてはアクチンをtargeted protein として, anti-アクチンantibody をimmobilized したナノ needleをThe insertion and removal of cells and the interaction between antigen and antibody are the key to unbinding. Force) is an evaluation of the mechanics of the intracellular structure and distribution of force. The AFM probe is made of a clustered needle with a diameter of about 200nm and a length of about 10μm. Anti-AKN antibodies are chemically modified and immobilized on the needle surface and cells are immobilized. Customize the insertion and removal of needles and the mechanics of needle insertion and removal. The analysis of the dimensional structure and the analysis of the decoupling process of the dimensional structure in the cell. Distribution analysisにおいてはGFP fusionβアクチンを発appearsさせたsmooth tendon cellsに対し、ストレスファイバーのDistribution is based on light observation and analysis of 19 × 19 points at 500nm intervals. Analysis of the dimensional structure, decoupling state, light identification, light staining, and unbinding force measurement, evaluation. The にる様子が観看され of the とも経time is reduced, the dimensional structure is broken and the された occasion is the unbinding force がゼロになることが分かった.これによりunbinding forceの大きさによって生structural structure inside the cell and its function and dimensional shapeアクチンをSpecial に検出する Method and として Useful であることが Show された.また, distribution analysis においては, ストレスファイバーの position と1nN or more の大きいunbinding Forceが検出されたにCorrelationが见られ、生きたThe distribution of bone lattice protein inside the cell is observed outることがshows instigationされた.

项目成果

Enzymatic nanolithography of FRET peptide layer using V8 protease-immobilized AFM probe

使用 V8 蛋白酶固定 AFM 探针对 FRET 肽层进行酶促纳米光刻

• 发表时间: 2007
• 期刊: Biosensors ＆ Bioelectronics 22
• 作者: 田中克志;市坪哲;松原英一郎;塩満一彦;渡辺和雄;高橋弘紀;Chikashi Nakamura 他
• 通讯作者: Chikashi Nakamura 他

セルサージェリー : ナノスケールの針で細胞を操作する

细胞手术：用纳米级针操纵细胞

• 发表时间: 2006
• 期刊: 産総研TODAY Vol.7, No.3
• 作者: 田中克志;市坪哲;松原英一郎;塩満一彦;渡辺和雄;高橋弘紀;Chikashi Nakamura 他;中村 史
• 通讯作者: 中村 史

免疫力学測定による生細胞タンパク質の検出方法

免疫动力学检测活细胞蛋白的方法

• 发表时间: 2005