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誘導型高発現遺伝子プロモーターの調節機構の解明および機能開発

阐明诱导型高表达基因启动子的调控机制和功能开发

基本信息

批准号：
17780074
负责人：
橋本義輝
金额：
$ 2.3万
依托单位：
University of Tsukuba
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
财政年份：
2005
资助国家：
日本
起止时间：
2005 至 2006
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-17780074/
关键词：
シュードモナスニトリル代謝発現クローニング塩基配列細菌

项目摘要

ニトリル分解菌Pseudomonas chlororaphis B23(以下、B23株と略)は、Nitrile hydratase (NHase)により様々なニトリルをアミドに変換し、生じたアミドをさらにAmidaseにより酸とアンモニアに分解する。両酵素は、ニトリルを合成する酵素Aldoxime dehydrataseなどのニトリル代謝関連酵素群とともに遺伝子クラスターを構成している。本遺伝子クラスターのプロモーターは発見できていない為、本クラスターはさらに上流まで伸びていると考えられた。前年度、上流のクローン化に成功し、取得した断片中からプロモーター領域を発見した。プロモーターのすぐ下流にレポーター遺伝子を導入し、レポーター酵素活性を測定することでプロモーター活性の検討を試みた。まず、数種の抗生物質を用いてB23株の薬剤耐性を調べ、感受性を示す抗生物質を探索した。次に、B23株が感受性を示す抗生物質耐性遺伝子を持ついくつかのプラスミドをB23株に導入し、B23株で複製可能なプラスミドを探索した。このプラスミドを用いて、レポーター遺伝子のすぐ上流にプロモーターと予想される断片を連結しB23株に導入した。しかし、B23株内に導入したものの、プラスミドは安定に保持されずプラスミドの欠失がおこり、レポーター酵素活性を測定することできなかった。前年度発見できた上流逆向きに転写調節タンパク質と相同性を示すORFを詳細に解析するために、本タンパク質の発現プラスミドを構築した。大腸菌を宿主として導入したところ、発現は確認できるものの全て不溶性穎粒となり、可溶性に発現する条件検討を行った。しかし、いずれの条件においても本タンパク質を可溶性に発現させることに成功しなかった。

Pseudomonas chlororaphis B23(hereinafter, strain B23 is omitted), Nitrile hydratase (NHase), and Amidase are used to produce and decompose NHase. The enzyme Aldoxime dehydratase is a member of the group of metabolism-related enzymes that are involved in the synthesis of enzymes. This is the first time I've ever seen a woman who's been in a relationship with someone else. In the previous year, the upper class was successfully transformed, and the fragments were obtained. The enzyme activity was measured in the presence of the enzyme. B23 strain was used to modulate its resistance and susceptibility to antibiotics. In addition, B23 strain showed susceptibility to antibiotic resistance, and B23 strain was introduced and cloned. This is the first time that the virus has been introduced into the genome. The enzyme activity of B23 strain was determined by enzyme analysis. The previous year's development of upstream and downstream regulatory mechanisms was discussed in detail. The conditions for the introduction and development of Escherichia coli into the host were discussed. The conditions for the discovery of soluble substances are as follows