誘導型高発現遺伝子プロモーターの調節機構の解明および機能開発

阐明诱导型高表达基因启动子的调控机制和功能开发

基本信息

批准号：
17780074
负责人：
橋本義輝
金额：
$ 2.3万
依托单位：
University of Tsukuba
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
财政年份：
2005
资助国家：
日本
起止时间：
2005 至 2006
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-17780074/
关键词：
シュードモナスニトリル代謝発現クローニング塩基配列細菌

项目摘要

ニトリル分解菌Pseudomonas chlororaphis B23(以下、B23株と略)は、Nitrile hydratase (NHase)により様々なニトリルをアミドに変換し、生じたアミドをさらにAmidaseにより酸とアンモニアに分解する。両酵素は、ニトリルを合成する酵素Aldoxime dehydrataseなどのニトリル代謝関連酵素群とともに遺伝子クラスターを構成している。本遺伝子クラスターのプロモーターは発見できていない為、本クラスターはさらに上流まで伸びていると考えられた。前年度、上流のクローン化に成功し、取得した断片中からプロモーター領域を発見した。プロモーターのすぐ下流にレポーター遺伝子を導入し、レポーター酵素活性を測定することでプロモーター活性の検討を試みた。まず、数種の抗生物質を用いてB23株の薬剤耐性を調べ、感受性を示す抗生物質を探索した。次に、B23株が感受性を示す抗生物質耐性遺伝子を持ついくつかのプラスミドをB23株に導入し、B23株で複製可能なプラスミドを探索した。このプラスミドを用いて、レポーター遺伝子のすぐ上流にプロモーターと予想される断片を連結しB23株に導入した。しかし、B23株内に導入したものの、プラスミドは安定に保持されずプラスミドの欠失がおこり、レポーター酵素活性を測定することできなかった。前年度発見できた上流逆向きに転写調節タンパク質と相同性を示すORFを詳細に解析するために、本タンパク質の発現プラスミドを構築した。大腸菌を宿主として導入したところ、発現は確認できるものの全て不溶性穎粒となり、可溶性に発現する条件検討を行った。しかし、いずれの条件においても本タンパク質を可溶性に発現させることに成功しなかった。

硝酸降解细菌假单胞菌叶绿素B23（以下简称为B23菌株）将各种硝酸酯转化为硝酸水合物（NHase），并被酰亚胺酶进一步分解为酸和氨的酰胺。这两种酶与一组硝酸代谢相关酶（例如酶醛酸氨基脱氢酶）形成基因簇，该酶合成了硝酸酶。由于尚未发现该基因簇的启动子，因此人们认为该群集已在上游进一步发展。上一年，上游克隆成功克隆，并在获得的片段中发现了启动子区域。我们试图通过引入启动子下游的报告基因并测量报告基因酶活性来研究启动子活性。首先，使用了几种抗生素来检查B23菌株的耐药性，并搜索了易感抗生素。然后将表现出敏感性的几种具有抗生素抗性基因的质粒引入B23菌株中，并搜索可以在B23菌株中复制的质粒。使用该质粒，将预测为启动子的片段立即在报告基因的上游连接，并引入B23菌株。然而，尽管将其引入了B23菌株中，但质粒并未稳定维持，并且质粒被删除，从而导致记者酶活性无法测量。为了详细分析上一年中发现与转录调节蛋白在上游反向方向上表现出同源性的ORF的ORF，构建了该蛋白的表达质粒。当将大肠杆菌作为宿主引入时，所有证实的表达式都是不溶性谷物，并检查了条件以使其溶解。但是，在任何条件下，蛋白质均未成功表达。