潜在する微生物テルペノイドの発掘及び新型テルペン環化酵素遺伝子の取得

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生合成研究:Mycobacterium chlorophenolicumから単離されたC_<35>環状テルペンはZ型のC_<35>直鎖状ポリプレニルニリン酸の環化反応によって生合成されると予想している。それを支持する証拠を得るため、市販の安価な試薬から容易に合成できる短鎖のC_<10>とC_<15>のポリプレニルニリン酸を基質として用いて無細胞抽出液と反応させた。E型のC_<10>ポリプレニルニリン酸は反応しなかったのに対し、Z型はC_<35>環状テルペンの部分構造と類似したリモネンを生成した。また、ω.E.E体のC_<15>のポリプレニルニリン酸も反応せず、ω, Z, Zで体は環化反応した。これらの結果は、Z型のポリプレニルニリン酸にのみ基質特異性をもつテルペン環化酵素が存在することを示していた。現在知られているテルペン環化酵素はE型を天然基質とするものだけであることから、新規性の高いテルペン環化酵素が存在していることが示唆された。遺伝子クローニング:昨年度までに2つのZ型プレニルトランスフェラーゼ遺伝子の一部を縮重プライマーによってクローニングしていた。今年度、染色体歩行によって上・下流の塩基配列を読み進んだ。高いGC含量の影響等により容易に読める配列ではなかったが、様々なシーケンス反応の条件を検討し改良した結果、Z型プレニルトランスフェラーゼ遺伝子の全長を読むことができた.現在、更に上・下流を読むことによってC_<35>環状テルペン生合成酵素の候補遺伝子を探している.また、2つのZ型プレニルトランスフェラーゼの生成物を同定するため、pET系ベクターで発現させる実験を進行した。