脂質一重膜界面とゴムのダイナミクスによるゴム合成活性発現と分子量制御機構の解明

通过脂质单层界面和橡胶动力学阐明橡胶合成活性表达和分子量控制机制

• 批准号: 22K19143
• 负责人: 山下 哲
• 金额: $ 3.99万
• 依托单位: Kanazawa University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Challenging Research (Exploratory)
• 财政年份: 2022
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2022-06-30 至 2025-03-31
• 项目状态: 未结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-22K19143/
• 关键词: 天然ゴム; イソプレノイド; 無細胞翻訳系

本研究は，天然ゴム生合成の未解決問題である「ゴム合成酵素の活性発現機構」と「ゴム分子量制御」を，ゴム貯蔵器官であるゴム粒子に存在する膜タンパク質・脂質およびゴム粒子内部のダイナミクスをキーとして解明することを目的としている。天然ゴムは植物が蓄積する疎水性高分子であり，平均分子量が100万に達するポリイソプレンである。天然ゴムはパラゴムノキの樹液として採取され，ゴム粒子(RP)と呼ばれる脂質小胞に格納されている。また，ゴム合成酵素はRPの膜表面にあり，モノマーを与えると，新規な重合反応により生じたゴムが膜を横切ってRP内部へ追加される。ラテックスには様々なサイズのRPが存在するが，平均粒径が小さいゴム粒子は高分子量ゴムを含み，表面酵素によるゴム重合活性が高い。それに対し，平均粒径がより大きいゴム粒子は，低分子量ゴムを含んでおり，表面酵素の重合活性が低い。このことから，ゴム合成酵素の活性は，膜に存在する因子や，膜の特性に依存して，変動している可能性が高い。RPの膜には多くの膜結合性タンパク質が存在するが，Rubber Elongation Factor（REF）が最も多量に含まれる。REFをRPやリポソームへ再構成すると，膜粒子が分裂する現象が観察されているため，生体膜の変形と出芽を誘発する因子であると考えられる。初年度の実績として，組換え型REFの発現と精製を行った。また，界面活性剤との混合ミセルとして精製したREFは，リポソームとの混合により，REFに脂質が吸着し，ベシクルが壊れることを確認した。また，その過程を高速AFMで再現性良く観察できることがわかった。REFによるゴム合成酵素の活性化機構の解明のため，15NラベルしたREFを調製し，精製を試みている。今後，ゴム合成酵素との共存による活性化機構と，その際の相互作用をNMR等を利用して解析する予定である。

This study aims to solve the unsolved problems of natural biosynthesis, such as the mechanism of enzyme activity and molecular weight control, and to solve the problems of membrane structure, lipid structure and particle internal structure in storage organs. The average molecular weight of the water-soluble polymers accumulated in natural plants is 1 million. Natural tree sap is used to produce lipid particles (RP) and lipid vesicles. In addition to the above, the new method of synthesizing enzyme RP is to add the enzyme to the surface of the membrane. The average particle size is small, the molecular weight is high, and the surface enzyme activity is high. In addition, the average particle size is high, the molecular weight is low, and the surface enzyme activity is low. The activity of these enzymes depends on the presence of membrane factors, and membrane properties are highly likely to change. RP membrane has many membrane bonding properties, and the Rubber Elongation Factor (REF) has the most properties. The phenomenon of membrane fragmentation is observed in the case of RP. The phenomenon of membrane fragmentation is observed in the case of RP. In the first year of the year, the performance of the company was improved. In addition, the interfacial active agent is mixed and refined, and the lipid adsorption is confirmed. The AFM has a high speed and reproducibility. Ref. 15N. Ref. In the future, the activation mechanism of synthase and its co-existence, and the interaction between them, such as NMR, will be used to determine the molecular structure.

项目成果

Structural basis and protein engineering of polyisoprenoid synthase

聚异戊二烯合酶的结构基础和蛋白质工程

• 发表时间: 2022
• 作者: Yahong Zou;Chan Lu;Takuya Katayama;Kazuhiro Iwashita;Jun-ichi Maruyama;三浦 夏子;安藤 友希;山下哲
• 通讯作者: 山下哲

Purification and Structural Analysis of a Membrane Protein Involved in Emulsification of Natural Rubber

参与天然橡胶乳化的膜蛋白的纯化及结构分析

• 发表时间: 2022
• 作者: 六車共平;Peni Ahmadi;今井恭祐;Tsung-Che Chang;Ambara R. Pradipta;田中克典;吉田城啓，黒澤悠太郎，林文晶，山口晴彦，島春奈，川端健太，竹下浩平， 宮城ゆき乃，片岡邦重，山下哲
• 通讯作者: 吉田城啓，黒澤悠太郎，林文晶，山口晴彦，島春奈，川端健太，竹下浩平， 宮城ゆき乃，片岡邦重，山下哲

Protein Engineering of the Regulatory Factor for Natural Rubber Synthase and its Structural Evaluation

天然橡胶合成酶调控因子的蛋白质工程及其结构评价

• 发表时间: 2022
• 作者: 矢内太朗;田村夏美;山口晴彦;宮城ゆき乃;竹下浩平;片岡邦重;戸澤譲;高橋征司;山下哲
• 通讯作者: 山下哲

脂肪滴およびゴム粒子の構造維持に関わる膜タンパク質の比較解析

参与维持脂滴和橡胶颗粒结构的膜蛋白的比较分析

• 发表时间: 2022
• 作者: 中山隆司，開琢海，三輪 幸祐，廣森 美樹，和氣 駿之，山下哲，戸澤 譲，山口晴彦，宮城ゆき乃;岩井 雅子，太田 啓之，中山 亨，高橋 征司
• 通讯作者: 岩井 雅子，太田 啓之，中山 亨，高橋 征司

天然ゴム生合成に関与する膜結合型タンパク質の末端構造の解析

天然橡胶生物合成中涉及的膜结合蛋白的末端结构分析

• 发表时间: 2022
• 作者: 吉田城啓，黒澤悠太郎，林文晶，山口晴彦，竹下浩平， 宮城ゆき乃，片岡邦重，山下哲