多分化能を有する羊膜幹細胞の超大量増幅と細胞バンク化へ向けた基礎的検討

多能羊膜干细胞超大规模扩增及细胞库的基础研究

• 批准号: 17591741
• 负责人: 原 鉄晃
• 金额: $ 2.37万
• 依托单位: Hiroshima University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• 财政年份: 2005
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2005 至 2007
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-17591741/
• 关键词: 再生医療; 羊膜; 幹細胞; 多分化能; 凍結

本年度は前年度に引き続き羊膜細胞の分離、培養法の基礎的知見を得るための研究と、細胞の未分化度の評価、分離した上皮由来細胞・間質由来細胞の骨分化能を検討する研究を実施した。1)羊膜幹細胞の分離・培養・同定のために、酵素処理およびメッシュ濾過法により間質由来細胞と上皮由来細胞の分離と培養を試みた。その結果DNase/hyaluronidase処理→トリプシン処理→フィルター濾過→フィルター濾過された細胞を上皮由来細胞、フィルター上の組織をコラゲナーゼ処理した細胞を間質由来細胞として分離した。従来法に比べ、上皮由来細胞への間質由来細胞の混入割合は減少したが、依然として完全な分離法は確立できておらず、更なる検討が必要である。2)羊膜幹細胞の未分化度の評価未分化細胞のマーカーとしてNanog、Oct-4、Rex-1、Sox-2の特異的プライマーを作製し、継代初期の細胞のRNAを用いてRT-PCRを行った。その結果、上皮由来細胞ではNanog、Oct-4、Rex-1が多く発現し、Sox-2も僅かながら発現していた。また、間質由来細胞においてもNanog、Oct-4が多く発現し、Rex-1、Sox-2も僅かに発現していた。このことより、羊膜幹細胞は未分化な細胞であり、種々の細胞への分化能を持つ可能性が示唆された。3)In vitroにおける羊膜細胞の骨分化能の検討間質由来細胞、上皮由来細胞をTissue culture dishに播種しconfluentになるまで培養後、従来法通りの骨誘導メディウムにて経時的に最長4週間培養し、Alizarin Red染色と、Osteocalcin特異的なプライマーを用いたRT-PCRを行った。その結果、間質由来細胞、上皮由来細胞ともに、全ての時期においてAlizafin Redによる染色とOsteocalcinの発現は確認できなかった。さらなる培養条件の検討が必要である。このようなデータの結果を踏まえ来年度は羊膜細胞の分離法についてさらに検討し、主に骨へ誘導するための有効な分化法についても検討を進めたい。

This year, we conducted research on the isolation of amniotic cells, basic knowledge of culture methods, evaluation of cell undifferentiation, isolation of epithelial-derived cells, and bone differentiation of mesenchymal cells. 1)Isolation and culture of amniotic stem cells, enzyme treatment and filtration Results DNase/hyaluronidase treatment → filtration → filtration → epithelial cells → interstitial cells → isolation The method of separation of epithelial cells and stromal cells is necessary. 2)Evaluation of the undifferentiated degree of amniotic stem cells: RNA from undifferentiated cells was detected by RT-PCR in the early stages of culture and control of specific proteins of Nanog, Oct-4, Rex-1 and Sox-2. As a result, epithelial-derived cells were found in Nanog, Oct-4, Rex-1 and Sox-2 cells. Nanog, Oct-4, Rex-1, Sox-2, etc. Amniotic stem cells are undifferentiated cells, and the possibility of cell differentiation can be demonstrated. 3)In vitro, the bone differentiation ability of amniotic cells was evaluated by RT-PCR for mesenchymal cells and epithelial cells. After seeding in Tissue culture dish, the bone differentiation ability of amniotic cells was evaluated by RT-PCR for 4 weeks at most. Results, Stromal origin cells, Epithelial-origin cells, and the whole time period were confirmed by Alizafin Red staining and Osteocalcin discovery. It is necessary to discuss the cultivation conditions. The results of this study were as follows: 1. The separation method of amniotic cells was studied in the future, and the main bone induction method was studied in the future.