真核生物型翻訳開始因子マルチ複合体の構造機能解析による翻訳開始機構の解明

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翻訳開始段階は翻訳終結やmRNA品質管理装置などと連携して,mRNAの代謝に深く関与する一方で,飢餓,ウイルス感染,酸化ショックや熱ショックなどのストレス,あるいは発生・分化やガン化などに応じて,細胞全体の翻訳量を制御することで細胞の活動度,ひいては生死をコントロールしている非常に重要なステップである.開始段階では12種類の開始因子が必須な役割を果たすことが知られているが,その中でもeIF1,eIF2-GTP-Met-tRNA_i,eIF3,eIF5はリボソームに結合する前段階でMulti-Factor Complex(MFC)を形成することが示されている.本研究はMFC全体あるいは部分複合体のX線結晶構造解析を行うことでMFC内部における開始因子間の相互作用やそれに伴う構造変化を解明し,開始因子の構造機能相関,開始因子間の機能的連携,そしてMFC形成の機能的意義を明らかにすることを目的としている.MFCの結晶構造解析を行うために酵母,紅藻,および古細菌由来の開始因子eIF1,eIF1A,eIF2,eIF2B,eIF3,eIF5,eIF5Bの発現系を構築し,eIF1-eIF3c-NTD,eIF2αβγ,eIF2β-eIF5,eIF1A-eIF5B複合体を大量調製することができた.うち古細菌由来eIF2α-CTDβγ-GDPAIF_4/ーGDPNP,eIF1A-eIF5B複合体,酵母由来eIF5B△Nに関して初期結晶を得ることに成功した.eIF2α-CTDβγ-GDPAIF_4/-GDPNPの初期結晶はサイズ小さく多結晶であったため回折実験には不適当であったが,初期結晶化条件に含まれていたイソプロパノールの代わりに界面活性剤DDAOを添加することで0.3mm角ほどの単結晶が得られ,約10Å分解能の回折像を得ることに成功した.eIF1A-eIF5B複合体の結晶は約10Å分解能の回折像を得ることに成功し,また,単離した結晶の電気泳動および質量分析より得られた結晶が間違いなく目的タンパク質の複合体の結晶であることを確認した.eIF5BΔNの結晶はNative体の結晶で3.1Å分解能のデータセットを収集することに成功しており,位相決定のためのeIF5BΔN Se-Met置換体結晶で約3.8Å分解能の回折を確認している.