真核生物型翻訳開始因子マルチ複合体の構造機能解析による翻訳開始機構の解明

通过真核翻译起始因子复合物的结构和功能分析阐明翻译起始机制

• 批准号: 18870001
• 负责人: 曽我部 正彰
• 金额: $ 1.74万
• 依托单位: Hokkaido University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Young Scientists (Start-up)
• 财政年份: 2006
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2006 至 2007
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-18870001/
• 关键词: 翻訳開始; 開始因子; tRNA; GTPase; 結晶構造解析; 複合体; 翻訳; 開始段階; X線結晶構造解析

翻訳開始段階は翻訳終結やmRNA品質管理装置などと連携して,mRNAの代謝に深く関与する一方で,飢餓,ウイルス感染,酸化ショックや熱ショックなどのストレス,あるいは発生・分化やガン化などに応じて,細胞全体の翻訳量を制御することで細胞の活動度,ひいては生死をコントロールしている非常に重要なステップである.開始段階では12種類の開始因子が必須な役割を果たすことが知られているが,その中でもeIF1,eIF2-GTP-Met-tRNA_i,eIF3,eIF5はリボソームに結合する前段階でMulti-Factor Complex(MFC)を形成することが示されている.本研究はMFC全体あるいは部分複合体のX線結晶構造解析を行うことでMFC内部における開始因子間の相互作用やそれに伴う構造変化を解明し,開始因子の構造機能相関,開始因子間の機能的連携,そしてMFC形成の機能的意義を明らかにすることを目的としている.MFCの結晶構造解析を行うために酵母,紅藻,および古細菌由来の開始因子eIF1,eIF1A,eIF2,eIF2B,eIF3,eIF5,eIF5Bの発現系を構築し,eIF1-eIF3c-NTD,eIF2αβγ,eIF2β-eIF5,eIF1A-eIF5B複合体を大量調製することができた.うち古細菌由来eIF2α-CTDβγ-GDPAIF_4/ーGDPNP,eIF1A-eIF5B複合体,酵母由来eIF5B△Nに関して初期結晶を得ることに成功した.eIF2α-CTDβγ-GDPAIF_4/-GDPNPの初期結晶はサイズ小さく多結晶であったため回折実験には不適当であったが,初期結晶化条件に含まれていたイソプロパノールの代わりに界面活性剤DDAOを添加することで0.3mm角ほどの単結晶が得られ,約10Å分解能の回折像を得ることに成功した.eIF1A-eIF5B複合体の結晶は約10Å分解能の回折像を得ることに成功し,また,単離した結晶の電気泳動および質量分析より得られた結晶が間違いなく目的タンパク質の複合体の結晶であることを確認した.eIF5BΔNの結晶はNative体の結晶で3.1Å分解能のデータセットを収集することに成功しており,位相決定のためのeIF5BΔN Se-Met置換体結晶で約3.8Å分解能の回折を確認している.

The initial stage of the transformation is the end of the transformation, the mRNA quality control device, the connection, the metabolism of mRNA is deeply related to one side, hunger, infection, acidification, heat, and so on, and the development, differentiation, and transformation of the whole cell is controlled, and the activity of the cell is very important, and the life and death are very important. In the beginning of the stage, there are 12 types of start factors that must be separated from each other. In the middle of the stage, there are eIF1, eIF2-GTP-Met-tRNA_i,eIF3,eIF5, which are combined with each other. In the first stage, there are Multi-Factor Complexes (MFC). This study is aimed to clarify the structural and functional correlation of initiation factors and functional linkage of initiation factors in MFC, and to clarify the functional significance of MFC formation. eIF1A,eIF2,eIF2B,eIF3,eIF5,eIF 5B complex is constructed. eIF1-eIF3c-NTD,eIF2αβγ,eIF2β-eIF5,eIF1A-eIF 5B complex is heavily modulated. EIF2 α-CTDβγ-GDPAIF_4/-GDPNP, eIF1A-eIF5B complex, yeast origin eIF5B △N, eIF2 α-CTDβγ-GDPAIF_4/-GDPNP, eIF5B △ N The initial crystallization conditions include the addition of DDAO, an interfacial active agent, and the successful crystallization of eIF1A-eIF5B complex with a decomposition energy of about 10. The crystal structure of the compound was determined by mass spectrometry.