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GST遺伝子をモデル系とした金属ストレスや酸化ストレスへの植物の応答機構の解析

以GST基因为模型系统分析植物对金属胁迫和氧化胁迫的响应机制

基本信息

批准号：
06F06429
负责人：
江崎文一
金额：
$ 0.9万
依托单位：
Okayama University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2006
资助国家：
日本
起止时间：
2006 至 2008
项目状态：
已结题

项目摘要

1)大腸菌内で大量生産させるためのプラスミドの構築:既にYulita博士らは大腸菌内で目的蛋白質を高発現させるベクターにAtGSTll遺伝子のAlストレス誘導性に関連する転写調節遺伝子の候補、3クローンを繋いでいた。しかし、これでは高発現はできなかった。そこで、まずこれらの塩基配列を確認する作業から着手した。その結果、どのクローンの場合もDNA配列に問題があることが判明した。そこで、新たに3クローンの連結のやり直し(プラスミドの再構築)を行った。これは再度、塩基配列を決定することで問題が無いことを確認した。これらのプラスミドは大腸菌に導入され、大量発現の系が完成した。2)大量生産化と精製:これらの大腸菌形質転換体を用いて大量発現の条件検討を行った。アラビノース添加濃度と発現誘導時間(アラビノース添加後の培養時間)について検討した。目的蛋白質の検出は、菌体内の全タンパク質をポリアクリルアミド電気泳動した後、ウェスタンブロット法で行った(目的蛋白質は、3'末端にMyc-Hisのタグペプチドが付随しているので、この部分に対する抗体を用いた)。その結果、アラビノース0.02%濃度で37度にて5時間処理する場合が最も効果的であると結論した。ただし、この場合でもその発現量はかなり低かった。なお、各蛋白質の分子量はタグの部分を含め36.5、39.9、37.0kDaと予想している。次に菌体内からの蛋白質抽出法と精製法の検討を行った。抽出は超音波破砕法を、精製法はアフィニティーカラムの原理を応用したキットで検討した。しかし、元々の発現量が少量のため、最終精製量は極少量であった。3)ゲルシフトアッセイ実験:精製した蛋白質を用いたゲルシフトアッセイを試みたが、やはり精製蛋白質の量は規定量より少なかったため、DNAバンドのシフトは観察されなかった。そこで、未精製の全蛋白質画分(超音波破砕画分)を用いて再度行った。その結果、構造遺伝子部分に最も近接した部位(プロモーターとしては最も下流部位に相当するF3)を用いた時に3つのクローンとも僅かながら結合性を観察することができた。このことからプロモーターの最下流部位が3者の結合部位であること、また3者にはDNA結合能があることが示唆された。

1)Construction of a protein system for mass production in E. coli: Dr. Yulita's high level of protein production in E. coli is related to the induction of Al in AtGSTl gene and the development of candidate regulatory genes.しかし、これでは高発现はできなかった。This is the first time that we have started the operation to confirm the basic configuration of this product. The result of DNA alignment is that the DNA alignment problem can be identified. The link between the new and new sites is straight (re-construction of the site). This is the first time I've ever seen a woman. The introduction of E. coli and the development of a large number of systems have been completed. 2)Mass production and purification: the conditions for mass production of Escherichia coli are discussed. The concentration and induction time (incubation time after addition) are discussed in detail. The protein of interest was isolated from the whole protein in the bacterium and then subjected to electroporation.(The protein of interest was isolated from the Myc-His protein at the 3'end and antibodies were used in this part.) The results show that the concentration is 0.02% and the treatment time is 37 degrees. In this case, the amount of light emitted is low. The molecular weight of each protein is 36.5 kDa, 39.9 kDa and 37.0 kDa. The protein extraction method and purification method were studied. Extraction of ultrasonic wave breaking method, refining method and application of ultrasonic wave breaking method The amount of refined products is only a small amount, and the final refined amount is a very small amount. 3) Refined protein is used in the test, and the amount of refined protein is determined according to the amount of DNA. The whole protein analysis (ultrasonic analysis) was carried out again. As a result, the structure of the sub-part of the most proximal part (F3) when used in the third part of the sub-part of the sub-part of the sub- The binding site of the lowest part of the DNA binding site is 3.