CDK9-サイクリンT複合体による発生・分化制御機構の解析

CDK9-cyclin T复合物发育和分化控制机制分析

• 批准号: 06J50312
• 负责人: 湯上 真人
• 金额: $ 0.64万
• 依托单位: Tokyo Institute of Technology
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2006
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2006 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-06J50312/
• 关键词: RNAi; レンチウイルス; 免疫染色

当研究室において、CDK9-サイクリンT複合体が転写伸長制御因子hSpt5をリン酸化することにより、hSpt5の機能制御を行っていることを報告し、さらにhSpt5に変異を持つゼブラフィッシュでは神経の発生分化に異常をきたすことが報告されている。そこで本研究ではCDK9-サイクリンT複合体が神経細胞の発生分化における機能を明らかとすることを目的とした。実験にはシナプス形成のモデル系であるラット副腎褐色細胞由来PC-12細胞を用いた。PC-12細胞は神経成長因子(NGF)刺激によって神経突起似の突起伸長が観察されることから、神経突起のモデルとして用いられている。RNAi法を行うにあたりPC-12細胞はトランスフェクション効率が低いことから、レンチウイルスによる遺伝子導入を試みた。CDK9をノックダウンするshort hairpinRNAを発現するレンチウイルスを作製し、CDK9のノックダウンを行った。CDK9が50%以下にノックダウンされていることをウエスタンブロット法により確認し、その条件化においてPC-12細胞のNGF刺激による神経突起様の突起伸長を観察したが、コントロールとほぼ変わりない突起伸長が観察され、免疫染色により分化マーカーの発現も確認された。また、Spt5およびSpt5と協調して転写伸長制御を行うNELFのサブユニットNELF-EのノックダウンもレンチウイルスによるRNAi法により行い、それぞれのタンパク質の発現が20%以下になっていることをウエスタンブロット法により確認した。CDK9同様、これらの因子をノックダウンしてもNGF刺激によるPC-12細胞の突起伸長は正常であった。よって、CDK9-サイクリンT複合体およびspt5はPc-12細胞をモデルとするような分化段階よりも、もっと初期の発生分化過程において神経の発生分化を制御していることが示唆された。

When the laboratory tests, CDK9-CDRT complexes are reported to contain elongation control factor hSpt5, functional control of hSpt5, and abnormalities in hSpt5 development. The purpose of this study is to clarify the function of CDK9-T complex in the development and differentiation of neurons. PC-12 cells are used in the formation of the cell line. PC-12 cells were stimulated by NGF to produce neurite-like process elongation. The RNAi method was used to test the gene transfer efficiency of PC-12 cells. CDK9 short hairpin RNA expression is controlled by CDK9 short hairpin RNA expression. CDK9 is less than 50%. It is confirmed by the method of conditioning and NGF stimulation of PC-12 cells. The elongation of neurites is detected by the method of immunostaining. The differentiation is confirmed by the method of immunostaining. The RNAi method was used to determine whether or not NELF was involved in the development of the NELF-E system. The RNAi method was used to determine whether or not NELF was involved in the development of the NELF system. CDK9 isoforms and related factors were used to stimulate the process elongation of PC-12 cells. The CDK9-T complex and spt5 are involved in the control of differentiation of Pc-12 cells during the early stages of differentiation.