CDK9-サイクリンT複合体による発生・分化制御機構の解析

当研究室において、CDK9-サイクリンT複合体が転写伸長制御因子hSpt5をリン酸化することにより、hSpt5の機能制御を行っていることを報告し、さらにhSpt5に変異を持つゼブラフィッシュでは神経の発生分化に異常をきたすことが報告されている。そこで本研究ではCDK9-サイクリンT複合体が神経細胞の発生分化における機能を明らかとすることを目的とした。実験にはシナプス形成のモデル系であるラット副腎褐色細胞由来PC-12細胞を用いた。PC-12細胞は神経成長因子(NGF)刺激によって神経突起似の突起伸長が観察されることから、神経突起のモデルとして用いられている。RNAi法を行うにあたりPC-12細胞はトランスフェクション効率が低いことから、レンチウイルスによる遺伝子導入を試みた。CDK9をノックダウンするshort hairpinRNAを発現するレンチウイルスを作製し、CDK9のノックダウンを行った。CDK9が50%以下にノックダウンされていることをウエスタンブロット法により確認し、その条件化においてPC-12細胞のNGF刺激による神経突起様の突起伸長を観察したが、コントロールとほぼ変わりない突起伸長が観察され、免疫染色により分化マーカーの発現も確認された。また、Spt5およびSpt5と協調して転写伸長制御を行うNELFのサブユニットNELF-EのノックダウンもレンチウイルスによるRNAi法により行い、それぞれのタンパク質の発現が20%以下になっていることをウエスタンブロット法により確認した。CDK9同様、これらの因子をノックダウンしてもNGF刺激によるPC-12細胞の突起伸長は正常であった。よって、CDK9-サイクリンT複合体およびspt5はPc-12細胞をモデルとするような分化段階よりも、もっと初期の発生分化過程において神経の発生分化を制御していることが示唆された。

当研究室において、CDK9-サイクリンT複合体が転写伸長制御因子hSpt5をリン酸化することにより、hSpt5の機能制御を行っていることを報告し、さらにhSpt5に変異を持つゼブラフィッシュでは神経の発生分化に異常をきたすことが報告されている。そこで本研究ではCDK9-サイクリンT複合体が神経細胞の発生分化における機能を明らかとすることを目的とした。実験にはシナプス形成のモデル系であるラット副腎褐色細胞由来PC-12細胞を用いた。PC-12細胞は神経成長因子(NGF)刺激によって神経突起似の突起伸長が観察されることから、神経突起のモデルとして用いられている。RNAi法を行うにあたりPC-12細胞はトランスフェクション効率が低いことから、レンチウイルスによる遺伝子導入を試みた。CDK9をノックダウンするshort hairpinRNAを発現するレンチウイルスを作製し、CDK9のノックダウンを行った。CDK9が50%以下にノックダウンされていることをウエスタンブロット法により確認し、その条件化においてPC-12細胞のNGF刺激による神経突起様の突起伸長を観察したが、コントロールとほぼ変わりない突起伸長が観察され、免疫染色により分化マーカーの発現も確認された。また、Spt5およびSpt5と協調して転写伸長制御を行うNELFのサブユニットNELF-EのノックダウンもレンチウイルスによるRNAi法により行い、それぞれのタンパク質の発現が20%以下になっていることをウエスタンブロット法により確認した。CDK9同様、これらの因子をノックダウンしてもNGF刺激によるPC-12細胞の突起伸長は正常であった。よって、CDK9-サイクリンT複合体およびspt5はPc-12細胞をモデルとするような分化段階よりも、もっと初期の発生分化過程において神経の発生分化を制御していることが示唆された。