ポリAポリメラーゼの構造基盤

聚腺苷酸聚合酶的结构基础

• 批准号: 18770101
• 负责人: 須藤 恭子
• 金额: $ 2.37万
• 依托单位: National Institute of Advanced Industrial Science and Technology
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
• 财政年份: 2006
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2006 至 2007
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-18770101/
• 关键词: 構造生物学; 核酸; 蛋白質; 酵素

生体内における核酸の伸長反応において,DNAあるいはRNA合成酵素は,一般的に核酸性の鋳型を用いてそれに相補的な配列を合成する。ポリAポリメラーゼ[Poly(A)polymerase]は,鋳型として核酸を用いることなく,決まった配列を付加・伸長する。ポリAポリメラ-ゼは,そのアミノ酸配列の相同性から,真核生物由来のポリAポリメラーゼのグループと真正細菌由来のポリAポリメラ-ゼのグループに分けられる。現在までに真核生物ポリAポリメラーゼのX線結晶構造解析は行われているが,真正細菌由来のポリAポリメラーゼの構造は未だに決定されていない。本研究では,真正細菌由来のポリAポリメラーゼを題材として,構造を基にした生化学的手法により,この酵素が鋳型を用いずにRNAを合成する分子機構を明らかにすることを目的としている。申請者は,前年度に大腸菌および緑膿菌由来のポリAポリメラーゼ結晶化を試みたが,良い結晶は得られなかった。今年度は,同じく真正細菌に属するChromobacterium由来のポリAポリメラvゼと,GeobactOr由来のポリAポリメラーゼについて,クローニングと大量発現,精製を行い,結晶化のスクリーニングを行った。しかし,良い結晶は析出しなかった。昨年,今年度と,4つの菌に由来するポリAポリメラ-ゼを扱ったが,いずれもやや溶解度が低いという特徴があったため,結晶が得られないのではないかと考えた。そこで,大腸菌のポリAポリメラーゼを使って,溶解度の高いコンストラクトの作成を試みた。その結果,C末欠損mutantよりも,tagの位置の変更が効果的で,最終的には溶解度が10mg/mlを超えるコンストラクトが得られた。このコンストラクトを使用して,結晶化のスクリーニングを行った。

In vivo nucleic acid elongation reaction,DNA synthesis, general nucleic acid type reaction, complementary synthesis Poly(A)polymerase is A type of nucleic acid that can be used in a variety of ways. The identity of the acid sequence of the eukaryotic organism is different from that of the true bacteria. Now, the X-ray crystal structure analysis of eukaryotes has been carried out, and the structure of true bacteria has not been determined. This study reveals the origin of bacteria and the molecular mechanisms for RNA synthesis. The applicant is not interested in the origin of Escherichia coli and Pseudomonas aeruginosa in the previous year. This year, the same true bacteria genus Chromobacterium origin of the complex A complex,GeobactOr origin of the complex A complex A complex, complex A complex, complex A complex A Good crystals precipitate. Last year, this year, the origin of 4 kinds of bacteria was mixed, the solubility was low, the crystallization was high, and the crystallization was high. For example, the preparation of E. coli and high solubility of E. coli. As a result,C terminal loss mutant,tag position change and effect, the final solubility of The crystallization process is carried out by using the crystal structure.