生理的条件で特異的配列が検出可能な核酸センサー蛋白質の創出

创建可以在生理条件下检测特定序列的核酸传感器蛋白

• 批准号: 17656264
• 负责人: 上田 宏
• 金额: $ 2.18万
• 依托单位: The University of Tokyo
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Exploratory Research
• 财政年份: 2005
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2005 至 2006
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-17656264/
• 关键词: 亜鉛フィンガー; ハイブリダイゼーション; 二量体; 蛋白質間相互作用; 分割GFP; フローサイトメトリー; 核酸センサー; 蛍光タンパク; Zinc Finger; hybridization; dimerization; protein-protein interaction; split GFP; flow cytometry; DNA sensor

これまでハイブリダイゼーション原理に基づくDNAセンサーの報告は数多いが,生理的条件特に生細胞内で二本鎖DNAを認識,検出することは極めて困難であった。本研究においては二本鎖DNAの特異的認識ユニットとしてZinc fingerタンパク質を用い,二個のZinc finger同士が細胞内の特異的配列の存在下二量体を形成した際にこれを蛍光強度などで検出することで特異的配列を持つ菌体を検出,選択する新規な手法の開発を目指した。昨年度までに二量体形成促進ペプチドのついたZif268由来の2個のZinc fingerの下流に,蛍光蛋白質であるeYFPを二個に分割したYNあるいはYCを結合させた二種類の蛋白質を同一大腸菌内で発現させることで,これらの特異的配列DNA依存的な近接の結果eYFPのfoldingおよび蛍光団形成が誘起されて細胞あたりの蛍光強度が顕著に強まることを確認した。しかしこの系ではZinc finger部分の配列特異性が8bp程度と甘いことも同時に明らかとなり,プラスミド上に14コピー程度の特異的配列リピートをもつ菌体でないと蛍光分光光度計およびフローサイトメトリーを用いて再現性のよい検出ができない問題も明らかとなった。そこで今年度はさらに片方のセンサータンパク質にZifドメインを1個追加し,認識配列を長くすることで染色体DNA中にある認識配列由来と思われるバックグラウンド蛍光を減らし,結果pUC19上の1コピーの13bpの認識配列を再現性よく検出することに成功した(20^<th>IUBMB International Congress, 2007/6,京都および2006年度日本生物工学会大会にて発表)。以上より当初の目的である生理的条件で特異的配列が検出可能な核酸センサー蛋白質が創出できたと考えられ,現在投稿論文としてまとめるために比較として試験管内再構成の実験を行っている。

こ れ ま で ハ イ ブ リ ダ イ ゼ ー シ ョ ン principle に base づ く DNA セ ン サ ー は の report more い が, physiological conditions, born に で 2 locks DNA を understanding, 検 out す る こ と は extremely め て difficult で あ っ た. This study に お い て は 2 lock の specific DNA know ユ ニ ッ ト と し て any Zinc finger タ ン パ ク を use い, two の any Zinc Finger with James の が cell specific arrangement の を 2 quantity body formation in the presence of し た interstate に こ れ を 蛍 light intensity な ど で 検 out す る こ と で specific arrangement を hold つ bacteria を 検, sentaku す る new rules な gimmick の open 発 を refers し た. The formation of までに diploids in the previous year promoted ペプチド ペプチド た たZif268 originated from <s:1> 2 <s:1> Zinc Finger の obscene に 蛍 light protein で あ る eYFP を two に segmentation し た YN あ る い は YC を combining さ せ た two kinds の protein を で within the same coliform 発 now さ せ る こ と で, こ れ ら の column with the specific DNA dependent な nearly meet の results eYFP の folding お よ び 蛍 light 団 form が induced さ れ て cells あ た Youdaoplaceholder0 蛍 light intensity が顕 に strong まる た とを とを confirm た. Youdaoplaceholder0 で Zinc Degree of finger の match column specificity が 8 bp と gump い こ と も simultaneously に Ming ら か と な り, プ ラ ス ミ ド に on 14 コ ピ ー degree の specific arrangement リ ピ ー ト を も つ bacteria で な い と 蛍 light spectrophotometer お よ び フ ロ ー サ イ ト メ ト リ ー を with い て reproducibility の よ い 検 out が で き な い problem も Ming ら か と な っ た. そ こ で our は さ ら に piece side の セ ン サ ー タ ン パ ク qualitative に Zif ド メ イ ン を 1 additional し, meet with long column を く す る こ と で chromosome DNA に あ る meet with column origin と thought わ れ る バ ッ ク グ ラ ウ ン ド 蛍 light を minus ら し, result pUC19 の 1 コ ピ ー の 13 bp の meet with column を reproducibility よ く 検 out す る こ と Youdaoplaceholder0 successful た(20^<th>IUBMB International Congress, 2007/6, Kyoto および2006 annual conference of the Japanese Society of Biotechnology にて release schedule). Above よ り の original purpose で あ る で specific physiological conditions with column が 検 makes possible な nucleic acid セ ン サ ー protein が hit で き た と exam え ら れ, now contribute papers と し て ま と め る た め に compare と し て test tube to constitute の be 験 を line っ て い る.

项目成果

The role of firefly luciferase C-terminal domain in efficient coupling of adenylation and oxidative steps

• DOI: 10.1016/j.febslet.2005.07.004
• 发表时间: 2005-08-15
• 期刊: FEBS LETTERS
• 影响因子: 3.5
• 作者: Ayabe, K;Zako, T;Ueda, H
• 通讯作者: Ueda, H

Enhanced fluorescence resonance energy transfer immunoassay with improved sensitivity based on the Fab'-based immunoconjugates.

基于 Fab 的免疫缀合物，增强型荧光共振能量转移免疫测定法具有更高的灵敏度。

• 发表时间: 2007
• 期刊: Anal. Biochem. 360・2
• 作者: Ohiro;Y.;Ueda;H.;Shibata;N.;Nagamune;T.
• 通讯作者: T.

生物工学ハンドブック(日本生物工学会編)

生物技术手册（日本生物技术学会编）

• 发表时间: 2005
• 作者: Ayabe;K.;Zako;T.;Ueda;H.;上田 宏(共著);上田 宏(共著)
• 通讯作者: 上田 宏(共著)

Importance of terminal residues on circularly permutated Escherichia coli alkaline phosphatase with high specific activity

• DOI: 10.1263/jbb.100.197
• 发表时间: 2005-08-01
• 期刊: JOURNAL OF BIOSCIENCE AND BIOENGINEERING
• 影响因子: 2.8
• 作者: Kojima, M;Ayabe, K;Ueda, H
• 通讯作者: Ueda, H