アミノ酸トランスポータATAの細胞内トラフィッキングを制御する分子群の同定

マウスATA2(mATA2)のポリクローナル抗体2種類をウサギを2羽ずつ用いて作製し、評価した。EGFP-mATA2をHEK293細胞に一過性に発現させ、ライセートを電気泳動し、ウェスタンブロットを行った。その結果、抗GFP抗体によるシグナルと一致するサイズに抗ATA2抗体のシグナルが得られるものがあった。内因性のATA2と思われるバンドも見られたが詳細は検討の余地がある。また、pull-down法によりATA2に結合する蛋白の情報を収集した。FLAG tagをつけたATA2コンストラクトを作製し、HEK293細胞に導入した。そのライセートを用いて抗FLAG抗体で免疫沈降を行い、質量分析計で蛋白の同定を行った。しかし、注目すべき特異的な蛋白は見つからなかった。前年度と合わせて本研究では、ATA2の細胞内トラフィッキングに関して、細胞膜へのtranslocation(exocytosis)にインスリンシグナル、degradationにプロテアソーム系の関与を明らかにし、更にポリユビキチン化によるinternalization(endocytosis)を示し、脂肪細胞におけるATA2の細胞内トラフィッキングの機構の詳細を明らかにした。つまり、本研究では、脂肪細胞におけるATA2のstorage→exocytosis→endocytosis→degradationもしくは再storageのモデルを完成させた。これらの成果の一部を第40回日本発生生物学会・第59回日本細胞生物学会合同大会でポスター発表した。また、これらの研究成果が認められ、第2回トランスポーター研究会にシンポジストとして招待され講演した。

マウスATA2(mATA2)のポリクローナル抗体2種類をウサギを2羽ずつ用いて作製し、評価した。EGFP-mATA2をHEK293細胞に一過性に発現させ、ライセートを電気泳動し、ウェスタンブロットを行った。その結果、抗GFP抗体によるシグナルと一致するサイズに抗ATA2抗体のシグナルが得られるものがあった。内因性のATA2と思われるバンドも見られたが詳細は検討の余地がある。また、pull-down法によりATA2に結合する蛋白の情報を収集した。FLAG tagをつけたATA2コンストラクトを作製し、HEK293細胞に導入した。そのライセートを用いて抗FLAG抗体で免疫沈降を行い、質量分析計で蛋白の同定を行った。しかし、注目すべき特異的な蛋白は見つからなかった。前年度と合わせて本研究では、ATA2の細胞内トラフィッキングに関して、細胞膜へのtranslocation(exocytosis)にインスリンシグナル、degradationにプロテアソーム系の関与を明らかにし、更にポリユビキチン化によるinternalization(endocytosis)を示し、脂肪細胞におけるATA2の細胞内トラフィッキングの機構の詳細を明らかにした。つまり、本研究では、脂肪細胞におけるATA2のstorage→exocytosis→endocytosis→degradationもしくは再storageのモデルを完成させた。これらの成果の一部を第40回日本発生生物学会・第59回日本細胞生物学会合同大会でポスター発表した。また、これらの研究成果が認められ、第2回トランスポーター研究会にシンポジストとして招待され講演した。