F0遺伝子ノックダウン法を用いた、心筋分化誘導・決定に関わる新規因子の同定と解析

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本研究は,ES細胞のin vitroにおける分化系を用いたDNAマイクロアレイ法により選抜された候補遺伝子群(CACHE;Cardiogenesis Associated genes from chipassay of Embryo Bodies と命名)の中から,興味深い発現パターンを示す遺伝子について,その機能をFOマウス個体における遺伝子ノックダウン法を用いて高効率に解析する事を目的としている。本年度は,研究実施計画に基づき,下記の内容について研究を行った。1.候補遺伝子の詳細な発現パターン解析前年度から引き続き,選抜された遺伝子の発現パターンを,心臓発生初期から時期を追ってwhole-mount in situ hybridization法により解析した。その結果,初期の心臓原基で発現している遺伝子としてCACHE1,4,9,20,心内膜において特徴的な発現をする遺伝子としてCACHE9,20,更に,近年,多くの先天性心疾患に関係すると考えられる第二心臓形成領域(secondary heart field)関連遺伝子としてCACHE20,また,心筋及び骨格筋の発生への関与が予想される候補遺伝子としてCACHE65を同定した。この成果を元に,ES細胞のin vitroの分化系においても心内膜が発生する事を証明した。2.マウス個体における遺伝子ノックダウン法を用いた機能解析システムの構築と検討。候補遺伝子の一つであるCACHE20について,マウス個体における遺伝子ノックダウン法を試みたが,遺伝子発現量を変化させるまでには至らなかった。その行程において,効率良くRNA干渉を行えるsiRNAを選抜する方法の必要性が判明した。そのため,効率良くsiRNAを選抜する方法を構築を試みた。また,遺伝子ノックダウン法以外に,従来のノックアウト法を用いた変異マウスの作製及び機能解析も開始した。