エキノコックス症化学療法剤の標的分子候補としてのシステインプロテアーゼの解析

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エキノコックス幼虫システインプロテアーゼを標的分子とする化学療法剤の開発のために必須である、その一次構造を決定し、性状の解析を試みた。本年度は、エキノコックス幼虫カテプシンB様システインプロテアーゼ(EmCtB)に関する解析を行った。1.カテプシンB様システインプロテアーゼ遺伝子のクローニングシステインプロテアーゼの酵素活性部位に高度に保存されたアミノ酸配列を基にプライマーを設計し、エキノコックス幼虫cDNAを鋳型としPCRを行い、システインプロテアーゼ遺伝子の一部分をクローニングした。既にクローニングしてあるシステインプロテアーゼ遺伝子をDNAハイブリダイゼーション法により除去することにより、新規遺伝子をクローニングした。DNA解析の結果、得られたクローンは、カテプシンB様システインプロテアーゼに相同性を示した。また、この遺伝子をEmCtBと命名した。2.エキノコックス幼虫での発現解析EmCtBに対するモノクローナル抗体を調整し、エキノコックス幼虫抽出抗原および分泌・排泄(ES)液に対してイムノブロット解析を行った結果、抽出抗原およびES抗原で25.6および26.4kDaの蛋白質が検出された。これらの結果より、両酵素が蛋白質レベルで発現していること、また、一部が分泌されていることが明らかとなった。次に、エキノコックス幼虫での局在を解析するために、免疫組織染色を行った。その結果、胚層、繁殖胞および原頭節で発現していることが確認できた。3.活性型EmCtBの発現活性型酵素を酵母(Pichia pastoris)を用いて発現させた結果、酵素活性を持つ十分量の組換え蛋白質を得ることが出来た。また、組換え酵素は高度に糖付加を受けている事が明らかとなった。