がん細胞転移を可視化するシステインプロテアーゼ蛍光プローブ

用于可视化癌细胞转移的半胱氨酸蛋白酶荧光探针

• 批准号: 18F18116
• 负责人: 菊地 和也
• 金额: $ 1.47万
• 依托单位: Osaka University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2018
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2018-04-25 至 2020-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-18F18116/
• 关键词: 蛍光プローブ; 蛋白質ラベル化; 超解像イメージング; 1分子イメージング; 破骨細胞

本年度はタンパク質を超解像で解析するため、蛍光の点滅を1分子単位で取得するイメージング法を利用したタンパク質ラベル化プローブの開発に取り組んだ。具体的には、標的タンパク質にラベル化する時は蛍光を発し、解離すると蛍光を発しない可逆性のラベル化プローブを設計した。このプローブには、標的タンパク質に対して特異的かつ可逆に結合が起こること、ならびに結合時のみに蛍光を発することが求められる。 融合発現可能なタグとして機能する標的タンパク質として、疎水性ポケットを有し、疎水性の匂い物質をリガンドとして可逆的に結合するOdorant Binding Protein (OBP)を選択した。リガンドとしては中程度のアルキル鎖長を有する脂肪酸を選択した。蛍光色素として、環境応答性を示す7-ジメチルアミノクマリン及びその誘導体を選択し、脂肪酸と連結しプローブを設計、合成した。OBPの組み換えタンパク質に対し、結合特性、蛍光特性を評価したところ、プローブを加えた際に蛍光強度の上昇が見られ、結合に伴い発蛍光性を有することが明らかとなった。またその結合定数はμM以上のオーダーであり、可逆的な結合に適した範囲の強さであることが分かった。また、リガンドおよびOBP配列の検討を行い、脂肪酸のアルキル鎖の最適化とOBPの結合ポケットにおけるアミノ酸変異によって結合時に20倍以上の蛍光上昇が観察された。このプローブを用いて生細胞におけるイメージングを行ったところ、細胞内局所に発現させたOBPをプローブにより迅速にラベル化できることが確認できた。さらに、洗浄操作によりプローブが解離し、蛍光シグナルが観察されなくなったことから、プローブが可逆的にタンパク質と結合し蛍光をスイッチさせることを示した。

This year, the analysis of super-resolution imaging and the point-extinguishing of 1 molecule unit were obtained this year. The るイメージング法をutilizes the したタンパク性ラベル化プローブの开発にGETり组んだ. Specific には, target タンパク性にラベル化する时は蛍光を発し, solution The design of the reversible design of the すると蛍光を発しない reversibility.このプローブには, the target タンパク性に対してspecific かつ reversible combination When the combination of こること and ならびにのみに蛍光を発することが为められる. Fusion of the standard タンパク性として and the water-based ポケット which can realize the functions of なタグとしてを有し、玎水的の匂い物をリガンドとして Reversible にcombinationするOdorant Binding Protein (OBP)を选択した.リガンドとしては Medium level のアルキル Lock length を有するFA を选択した.として, Environmental Responsiveness 7-ジメチルアミノクマリン and Design and synthesis of びその inducer をselection and fatty acid と linkage しプローブを. OBP's group みchange えタンパク性に対し, bonding characteristics, light characteristics をreview価したところ, プローブをAdd the light intensity of the light intensity to rise and see the light, and combine the light intensity of the light with the light intensity to have the light. The combination of またその has a fixed number of はμM and above, and the reversible なcombination is suitable for use.また, リガンドおよびOBP arrangement の検question を行い, fatty acid のアルキル lock のoptimization とOBPのWhen combined with the ポケットにおけるアミノ acid によって, the light rises more than 20 times.このプローブを Use いて生码におけるイメージングを行ったところ、Cell internal stationに発appearsさせたOBPをプローブによりquickly にラベル化できることがconfirmできた.さらに、washing operation によりプローブがdissociationし、荍光シグナルが観看されなくなったことから、プローブが Reversible にタンパク性とcombinationし蛍光をスイッチさせることをshowした.

项目成果

イメージングプローブのデザイン・合成によるケミカルバイオロジー研究

通过设计和合成成像探针进行化学生物学研究

• 发表时间: 2019
• 作者: 小阪 高広;山口 哲志;泉田 森;岡本 晃充;Akinori Kuzuya;Tsutomu Suzuki;菊地 和也
• 通讯作者: 菊地 和也

New Biological Findings Which Were Clarified by Designed Chemical Probes

通过设计的化学探针阐明了新的生物学发现

• 发表时间: 2018
• 作者: 耒代誠仁;高田祐一;井上幸;方国花;馬場基;渡辺晃宏;井上聡;Kikuchi Kazuya
• 通讯作者: Kikuchi Kazuya

In vivo Chemical Probes for MRI and Fluorescence Imaging

用于 MRI 和荧光成像的体内化学探针

• 发表时间: 2019
• 作者: 小阪 高広;山口 哲志;泉田 森;岡本 晃充;Kikuchi Kazuya
• 通讯作者: Kikuchi Kazuya

Perfluorocarbon-Based (19) F MRI Nanoprobes for In Vivo Multicolor Imaging.

• DOI: 10.1002/anie.201810363
• 发表时间: 2018-12-17
• 期刊: Angewandte Chemie (International ed. in English)
• 作者: Akazawa K;Sugihara F;Nakamura T;Matsushita H;Mukai H;Akimoto R;Minoshima M;Mizukami S;Kikuchi K
• 通讯作者: Kikuchi K

Development of an effective protein-labeling system based on smart fluorogenic probes

• DOI: 10.1007/s00775-019-01669-y
• 发表时间: 2019-05
• 期刊: JBIC Journal of Biological Inorganic Chemistry
• 作者: S. I. Reja;Masafumi Minoshima;Y. Hori;K. Kikuchi