がん細胞転移を可視化するシステインプロテアーゼ蛍光プローブ

用于可视化癌细胞转移的半胱氨酸蛋白酶荧光探针

基本信息

批准号：
18F18116
负责人：
菊地和也
金额：
$ 1.47万
依托单位：
Osaka University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2018
资助国家：
日本
起止时间：
2018-04-25 至 2020-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

本年度はタンパク質を超解像で解析するため、蛍光の点滅を1分子単位で取得するイメージング法を利用したタンパク質ラベル化プローブの開発に取り組んだ。具体的には、標的タンパク質にラベル化する時は蛍光を発し、解離すると蛍光を発しない可逆性のラベル化プローブを設計した。このプローブには、標的タンパク質に対して特異的かつ可逆に結合が起こること、ならびに結合時のみに蛍光を発することが求められる。融合発現可能なタグとして機能する標的タンパク質として、疎水性ポケットを有し、疎水性の匂い物質をリガンドとして可逆的に結合するOdorant Binding Protein (OBP)を選択した。リガンドとしては中程度のアルキル鎖長を有する脂肪酸を選択した。蛍光色素として、環境応答性を示す7-ジメチルアミノクマリン及びその誘導体を選択し、脂肪酸と連結しプローブを設計、合成した。OBPの組み換えタンパク質に対し、結合特性、蛍光特性を評価したところ、プローブを加えた際に蛍光強度の上昇が見られ、結合に伴い発蛍光性を有することが明らかとなった。またその結合定数はμM以上のオーダーであり、可逆的な結合に適した範囲の強さであることが分かった。また、リガンドおよびOBP配列の検討を行い、脂肪酸のアルキル鎖の最適化とOBPの結合ポケットにおけるアミノ酸変異によって結合時に20倍以上の蛍光上昇が観察された。このプローブを用いて生細胞におけるイメージングを行ったところ、細胞内局所に発現させたOBPをプローブにより迅速にラベル化できることが確認できた。さらに、洗浄操作によりプローブが解離し、蛍光シグナルが観察されなくなったことから、プローブが可逆的にタンパク質と結合し蛍光をスイッチさせることを示した。

为了分析今年超分辨率的蛋白质，我们使用一种成像方法来开发蛋白质标记探针，从而获得一个分子中的荧光闪烁。具体而言，设计了可逆的标记探针，该探针在标记靶蛋白时会发出荧光，并且在解离时不会发出荧光。该探针必须与靶蛋白具有特定且可逆的结合，并仅在结合后发出荧光。作为功能可表达融合标签的靶蛋白，气味结合蛋白（OBP）具有疏水口袋，并且可逆地结合疏水性气味作为配体。作为配体，选择具有中等烷基链长度的脂肪酸。选择荧光染料，选择7-二甲基氨基氨基氨基蛋白酶及其衍生物，并通过与脂肪酸链接来设计和合成探针。当评估重组蛋白的OBP的结合和荧光特性时，添加探针时会增加荧光强度，并发现它由于结合而具有荧光性能。还发现结合常数在μm或更高的阶内，强度在适合可逆结合的范围内。此外，检查了配体和OBP序列，并在OBP的结合袋中优化脂肪酸和氨基酸突变，观察到结合时观察到20倍的荧光增加。当使用该探针在活细胞中进行成像时，可以证实，可以用探针迅速将局部表达的OBP迅速标记。此外，探针与洗涤过程解离，不再观察到荧光信号，表明该探针可逆地与蛋白质结合并切换荧光。