ヒト誘導型制御性T細胞培養液中に存在する細胞増殖抑制因子の同定と応用に関する研究

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(1)ラパマイシン誘導ヒト制御性T細胞の産生する細胞増殖抑制因子の分離精製およびアミノ酸配列:健常人ボランティアより得た末梢血より,密度勾配遠心法により単核球を分離後,磁気ビーズ法を用いてCD4+T細胞を分離し,ラパマイシン及びIL-2存在下,抗ヒトCD3/CD28結合ビーズを用いて連続刺激することにより,細胞を培養増殖させた.細胞数が目的の量に達した段階で,細胞を洗浄し,ラパマイシンおよびIL-2を除き,無血清培養液を用いて,4日間培養後,培養液を回収した.得られた培養液を添加することにより,ヒト末梢血単核球の抗ヒトCD3抗体刺激による細胞増殖活性は,濃度依存的に抑制された.得られたラパマイシン誘導制御性T細胞の培養液を限外ろ過/遠心式フィルターにより濃縮し,ゲルろ過カラムクロマトグラフィー法により培養液中の細胞増殖抑制因子を分離した結果,細胞増殖抑制活性は,分子量約10kDの分画中に認められた.さらに,SDS-PAGE法により分離後,質量分析装置により解析した結果,3種類のタンパク質が同定された.(2)培養上清を用いた増殖抑制因子の生物活性の検討:細胞増殖制活性を持つ培養上清を濃縮後,マウス同種異系皮膚移植モデルに投与し,移植拒絶抑制効果に関して検討した.マウス皮膚移植モデルは,BalbヌードマウスにC57BL/6マウスの皮膚を移植し,Balb/cマウスより得たT細胞を移入することにより,拒絶を誘導した.濃縮培養培養上清投与群の皮膚移植拒絶期間は,コントロール群と比較し場合に,統計的有意な差は認められなかった.