ピリドキサミン-ピルビン酸アミノトランスフェラーゼの立体構造解析と機能改変

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近年,ピリドキサミンが糖尿病合併症の予防および治療薬として期待され,抗老化物質として,食品,化粧品分野からも注目されている.ピリドキサミンは現在化学合成されているが,環境および経済的な配慮から発酵法もしくは酵素法での生産が望ましい.そこで,酵素ピリドキサミン-ピルビン酸アミノトランスフェラーゼ(PPAT)を利用したピリドキサールからピリドキサミンの生産系を検討してきた.本年度は,合成コストをさらに減少させるために,PPATの基質特異性をL-アラニンからより安価なL-グルタミン酸に改変することを目的とした.野生型PPATのL-グルタミン酸に対する反応性は,L-アラニンに対する反応性の1%以下であった.そこで,立体構造に基づく分子デザインやerror-prone PCRを用いたランダム変異等のタンパク質工学的手法を駆使し,PPATの基質特異性の改変を試みた.酵素活性を指標にスクリーニングを行ったところ,野生酵素のL-アラニンに対する反応性に匹敵し,大幅にL-グルタミン酸に対する親和性が増加した3重変異酵素が得られた.得られた変異酵素のL-グルタミン酸複合体の高次構造を解析したところ,変異残基がL-グルタミン酸のγ-カルボキシル基と相互作用できることが明らかとなった.得られた変異酵素を発現させた大腸菌細胞を触媒として,ピリドキサールおよびL-グルタミン酸を基質として合成反応を行ったところ,収率よくピリドキサミンを合成することでできた.以上より,ピリドキサールとL-グルタミン酸から効率よくピリドキサミンを合成することが可能となった.