Energetik- und Calcium-Regulation bei stimulierter Exocytose in Paramecium-Zellen

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In Paramecium-Zellen wird die getriggerte, synchrone (0.1 sec) Exocytose begleitet von einem dramatischen ATP-Verbrauch und der Dephosphorylierung eines Phosphoprotein von 63kDa, PP63/Parafusin (pf), und zwar strikt im Ausmass der stattfindenden Exocytose von "dense core"-Vesikeln ("Trichocysten"). Dieses wird gefolgt von langsamer (30 sec) Rephosphorylierung und Füllung des ATP-Pools. Obwohl PP63/pf in exo- Stämmen gleich vorhanden ist, wird PP63/pf nur in exocytosefähigen exo+ Stämmen dephosphoryliert, bei zeitlich versetzter Doppeltriggerung strikt im Ausmass der Assemblierung von Dock-/Fusionstellen bzw. der Trichocysten-Exocytose. Dabei setzen wir auf Grund von "Knock-out"-Experimenten an Tetrahymena voraus, dass die PP63 Dephosphorylierung nichts mit Membranfusion zutun hat, sondern nur "downstream"-Effekte bewirken kann. Unsere Klonierungsarbeiten zeigten, dass PP63/pf identisch ist mit Phosphoglukomutase (PGM) und auch nach heterologer Expression PGM Aktivität hat. Die funktionelle Bedeutung der De-/Re-Phosphorylierung von PP63/pf/PGM in strikter Koppelung mit dem Exocytoseablauf bleibt aufzuklären. Trotz der ubiquitären Verbreitung von PP63/pf bietet sich unser System in besonderem Masse zu Analyse an: Wegen seiner strikten Synchronizität (De- und Re-Phopsphorylierung können ohne Überlagerung analysiert werden), der Möglichkeit einer räumlichen (Immunmethoden) und zeitlichen (Quenched-flow) Zuordnung, der Isolierbarkeit der relevanten Komponenenten und der Möglichkeit funktioneller Tests in vitro und in vivo unter Einschluss von "Gene silencing" und Überexpression. Unsere Arbeiten zielen u.a. auf Mikrodomänen-Regulation energetischer Prozesse des Exocytoseablaufes.