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NMRを用いたフェレドキシン―キノン還元酵素の機能解明

使用 NMR 阐明铁氧还蛋白醌还原酶的功能

基本信息

批准号：
19890049
负责人：
上田卓見
金额：
$ 1.97万
依托单位：
The University of Tokyo
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Young Scientists (Start-up)
财政年份：
2007
资助国家：
日本
起止时间：
2007 至 2008
项目状态：
已结题

项目摘要

安定同位体標識を施したフェレドキシン(Fd)を、大腸菌BL21(DE3)-CodonPlus-RPを用いて大量発現させ、Sepharose 6B、 Resource PHE、 Hiload Superdex 75カラムを用いて、SDS-PAGEにて単一バンドとなるまで精製した。Fdの[2Fe-2S]クラスターは不対電子を持つため、その近傍のNMRシグナルは観測されない。そこで、その影響を見積もるため、Fdの主鎖に由来するNMRシグナルの連鎖帰属を行った。その結果、[2Fe-2S]クラスターの5Å以内に存在するY37-A48およびT76-A79のアミノ酸に対応するシグナルは観測されなかった。次に、Fd上の光化学系Iとの特異的相互作用残基を同定するために、Fdと可溶化した光化学系Iを混合し、TCS実験を行った。さらに、FQRとの相互作用を検出するために、光化学系IおよびFQRのFd結合界面が外側を向いた、right side-outベシクルを用いたTCS実験も行った。両TCS実験の結果を比較すると、K52近傍、D66近傍、V82近傍およびE30-I33は両方のTCS実験においてシグナル強度減少が観測されているのに対し、K4およびD84はベシクルとのTCS実験のみでシグナル強度減少が観測された。このことから、K52近傍、V82近傍、D66近傍およびE30-I33は、PSIとの結合界面上に存在し、K4およびD84はFQRとの結合界面に存在すると結論した。近年、低分子量チラコイド膜タンパク質PGR5がFQRの活性に必須であることが示された。しかし、PGR5がFdと直接相互作用しているか否かは明らかではない。PGR5変異株から調製したチラコイド膜ベシクルを用いたTCS実験における、K4およびD84の強度減少を調べることにより、この点を明らかにしたいと考えている。

Stable Isotope Identification (Fd), Escherichia coli BL21 (DE3)-CodonPlus-RP, Sepharose 6B, Resource PHE, Hiload Superdex 75, and SDS-PAGE were used to purify the isoforms. Fd and [2Fe-2S] ions are not detected by electron spectroscopy. The main lock source of Fd is NMR. As a result,[2Fe-2S] can be found in the range of 5 ° C to 10 ° C, and Y37-A48 and T76-A79 can be found in the range of 5 ° C to 10 ° C. The specific interacting residues of the photochemical system I on Fd are identical, Fd is soluble, and TCS is soluble. The interaction between FQR and TCS is carried out in the outer direction and in the right side-out direction. Comparison of TCS implementation results: K52, D66, V82 and E30-I33 TCS implementation results: TCS implementation results: The conclusion is that there exists a bonding interface between PSI and PSI near K52, near V82, near D66 and E30-I33, and a bonding interface between K4 and D84 and FQR. In recent years, low molecular weight film quality PGR5 has been shown to be essential for FQR activity. PGR5 Fd Direct interaction PGR5 is different from TCS, K4 and D84 in intensity reduction.