ヘルパーエピトープを含むマルチエピトープアプローチによる新規癌ワクチン治療の開発

使用包括辅助表位在内的多表位方法开发新型癌症疫苗治疗

• 批准号: 23591968
• 负责人: 伊藤 剛
• 金额: $ 3.41万
• 依托单位: Kyoto Prefectural University of Medicine
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• 财政年份: 2011
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2011 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-23591968/
• 关键词: 腫瘍免疫学; 癌ワクチン療法

EV法による免疫後のCTL反応を詳細に検討するために、モデル抗原としてOVA蛋白由来のKb拘束性エピトープであるSIINFEKLをコードする遺云子を合成した後、これを組み込んだプラスミドを作製した。プラスミドは哺乳動物由来の細胞で発現し得るpcDNA3(Invitrogen社)を用いた。ワクチンは以下の方法で行った。まず、プラスミド200μgを全身麻酔下のマウス(C57BL/6)両大腿四頭筋内に半分づつ注射する。その後同注射部位にin vivoエレクトロポレーションを行う(BTX社ECM830)。2-Needle Array Elect rodeを注射部位をはさんで挿入して、100V,50msec,6pulsesの設定で通電を行う(一度re-poleを行い計2回通電)。免疫回数を1回と2回で比較する。免疫後7日、14日、21日の3タイムポイントでマウスを儀死させ、所属リンパ節と脾臓を採取する。CD8+T細胞中のCTL細胞数をKb/SIINFEKLテトラマー(PE conjugated)(Coulter社製)で検出する。テトラマーによる染色は同時に抗ClassII/FITC抗体、抗CD8/PerCP抗体を用いて行い、FACSCaliburで解析する。テトラマーのみの評価では実際の殺細胞効果の検討を行うことができないので、各タイムポイントにおける機能面の解析をin vivo cytotoxic assay法で行う。同アッセイの方法は、同系マウス(CD90.1発現,BL6PLマウス)から採取した同種脾細胞を2群にわけ、一方に高濃度(50mM)CFSE染色を、他方に低濃度(5mM)CFSE染色を施した後、高濃度染色群のみペプチドパルスを行っておく。そして2群の細胞数を同数づつ混ぜ合わせたものを尾静脈から経静脈投与し、48時間後に回収した脾臓から、細胞浮游液を調整して、その中に存在する両群の細胞数の比を取って、殺細胞効果を検討する。免疫されたマウスでは誘導されるCTLによって、高濃度群(ペプチドパルス群)の細胞が殺傷される事により、相対的に低濃度群の細胞が増加する。結果としては、モデル抗原であるOVA特異的な免疫反応を確認する事ができた。In vivo cytotoxic assayではコントロール群と比較して優位な殺細胞効果を確認する事ができた。次のステップとしては以下の実験を順次行って行く予定である。OVAに由来するMHCクラスII拘束性ペプチドであるOVA_<323-339>(ISQAVHAAHHAEINEAGR)をコードするプラスミドを同様に作製してマウスを免疫し、ヘルパーT細胞の活性を測定する。測定には免疫マウスのCD4T細胞をエフェクター細胞として、OVAタンパクもしくはOVA32_<323-339>ペプチドでパルスした脾細胞をターゲット細胞とした細胞増殖活性を測定して評価する。

EV method に よ る immune after の CTL against 応 を detailed に beg す 検 る た め に, モ デ ル antigen と し て OVA protein origin の Kb at エ ピ ト ー プ で あ る SIINFEKL を コ ー ド す る heritage cloud son を synthetic し た, こ れ を group み 込 ん だ プ ラ ス ミ ド を cropping し た. Youdaoplaceholder0 プラス ド ド ド mammalian origin of cells で occurrence of るpcDNA3(Invitrogen society)を use of た た. Youdaoplaceholder0 チ チ チ った った the following <s:1> method で line った. ま ず, プ ラ ス ミ ド 200 mu g を general ma 酔 の マ ウ ス (C57BL / 6) within the four head struck the thigh muscle に half づ つ injection す る. Youdaoplaceholder0 トロポレ followed by にin vivoエレ トロポレ トロポレ ショ ショ を を う at the injection site う(BTX ECM830). 2-Needle Array Elect rodeを injection site を を さんで さんで insert <s:1> て, 100V,50msec,6pulses て set で energiation を rows う(one re-poleを row う counts as two energiations). Comparison of the number of immune cycles: を1 cycle と2 cycles で する. Immune after 7, 14, 21, 3 タ の イ ム ポ イ ン ト で マ ウ ス を instrument death さ リ せ, belong to ン パ section と splenic を take す る. The number of <s:1> CTL cells in CD8+T cells is をKb/SIINFEKLテトラ テトラ (PE conjugated)(Coulter system)で検 する. Youdaoplaceholder0, テトラ, による, による staining テトラ and に simultaneously に, anti-Class ii /FITC antibody and anti-CD8 /PerCP antibody を were analyzed する by で て line で and FACSCaliburで. テ ト ラ マ ー の み の review 価 で は be interstate の kill cells working fruit の 検 line for を う こ と が で き な い の で, various タ イ ム ポ イ ン ト に お け surface analytical を の る function in vivo cytotoxic で line う assay method. With ア ッ セ イ の way は, homologous マ ウ ス (CD90.1 発, BL6PL マ ウ ス) か ら take し た same を 2 group of spleen cells に わ け, one party に high concentration (50 mm) CFSE staining を に low concentration (5 mm), the other party CFSE staining を し shi, high concentration of dyeing group after た の み ペ プ チ ド パ ル ス を line っ て お く. そ し て 2 group of を の cell population with few づ つ mixed ぜ close わ せ た も の を caudal vein か ら 経 vein and し, after 48 time に back 収 し た splenic か ら, liquid cell planktonic を adjustment し て, そ の に exist す る struck group の cell number の than を take っ て, kill cells working fruit を beg す 検 る. Immune さ れ た マ ウ ス で は induced さ れ る CTL に よ っ て, high concentration group (ペ プ チ ド パ ル ス group) の cells が さ れ る matter に よ り, phase of seaborne に が raised with low concentration group of の cells す る. Results と し て は, モ デ ル antigen で あ る OVA specific な immune against 応 を confirm す る matter が で き た. The In vivo cytotoxic assay で は コ ン ト ロ ー ル group と compare し て optimal bit sharper fruit を な kill cells confirmed す る matter が で き た. The following <s:1> ステップと て て て the actual experiments を are followed in sequence by って lines く to determine である. OVA に origin す る MHC ク ラ ス II committed ペ プ チ ド で あ る OVA_ < > 323-339 (ISQAVHAAHHAEINEAGR) を コ ー ド す る プ ラ ス ミ ド を with others に cropping し て マ ウ ス を immune し, ヘ ル パ ー t-cell を の activity determination す る. Determine に は immune マ ウ ス の CD4T cells を エ フ ェ ク タ ー cells と し て, OVA タ ン パ ク も し く は OVA32_ < 323-339 > ペ プ チ ド で パ ル ス し た spleen cells を タ ー ゲ ッ ト cells と し た を raised colonization activity determination し て review 価 す る.