ポリアルギニンとHA2を用いた胎児期内耳(耳胞)への蛋白質導入法

使用聚精氨酸和 HA2 将蛋白质引入胎儿内耳（耳囊）的方法

• 批准号: 23791908
• 负责人: 三輪 徹
• 金额: $ 2.66万
• 依托单位: Kumamoto University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
• 财政年份: 2011
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2011 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-23791908/
• 关键词: 蛋白質導入法; ポリアルギニン; 胎生期内耳; ヘマグルニチン; p27^<KiP1>

内耳原基である耳胞に操作を加えること、遺伝性難聴の治療法としてまたは発生過程にある内耳における遺伝子や蛋白質の機能を調べる上でも、魅力的な方法である。一方、蛋白質導入法は、遺伝子の翻訳産物である蛋白質を直接細胞に導入し、その機能を解析する方法である。我々は、富澤らの好意によりポリアルギニンをN末端に9個付加したEGFP(EGFP-9R)と11個付加したEGFP(EGFP-11R)の供与を受け、既にポリアルギニンを用いて胎生期内耳(耳胞)へ正常蛋白質を導入することに成功していたため、サイクリン依存性キナーゼ阻害因子p27^<KiP1>を用いて、耳胞での細胞内情報伝達制御が可能であるかどうか検討することを目的とした。p27^<KiP1>は、内耳原基細胞で発現しており細胞周期を抑制し、増殖・分化を抑制することが報告されている(Lee YS, Development 133, 2006)。そこでまず、本年度はマウスcDNAライブラリーより、クローニングキットを用いp27^<KiP1>をクローニングし、p27^<KiP1>プラスミドを作製し、EGFP-9Rにp27^<KiP1>を組み込んだ融合蛋白質(EGFP-p27^<KiP1>-9R)とEGFP-p27^<KiP1>-11Rを作成した。蛋白質導入法の欠点としては、導入した蛋白質の発現時間が短いことが挙げられる。この対策として、MichiueらはインフルエンザウイルスのヘマグルチニンHA2サブユニットを用いたマクロピノソームリリーシングペプチドによるリリーシング技術を報告した(J Biol Chem, 280, 2005)。この技術により、蛋白質の発現時間延長が可能となった。EGFP-9Rにp27^<KiP1>とHA2を組み込んだ融合蛋白質(EGFP-HA2-p27^<KiP1>-9R)とEGFP-HA2-p27^<KiP1>-11Rを作成した。また、EGFP-p27^<KiP1>-9R、EGFP-p27^<KiP1>-11Rを正常マウス耳胞(E11.5)へ投与し、内耳原基細胞の細胞周期が抑制されるかを確認するための予備実験として、EGFP-9R、EGFP-11Rを導入したマウスの胎仔頭部を離断し、固定を行った後、凍結切片を作成し、免疫染色にて内耳原基細胞でのp27^<KiP1>の発現を確認した。

Inner ear primordia で あ る ear cell に を operation plus え る こ と, but 伝 difficult 聴 の therapy と し て ま た は 発 birth process に あ る inner ear に お け る posthumous son 伝 や protein の function を adjustable べ る on で も, charm な method で あ る. Side, protein import は product, but 伝 の turn 訳 で あ る protein を cell に directly import し, そ の function analytical す を る method で あ る. I 々 は, fu ze ら の kindness に よ り ポ リ ア ル ギ ニ ン を N terminal に nine plus し た EGFP (EGFP - 9 r) と 11 plus し た EGFP (EGFP - 11 r) の を け, and supply both に ポ リ ア ル ギ ニ ン を with い て TaiShengQi inner ear cell (ears) へ normal protein を import す る こ と に successful し て い た た め, サ イ ク リ ン dependency キ ナ ー ゼ resistance against factor p27 ^ < KiP1 > を with い て, ear cell で の intracellular intelligence 伝 royal が making possible で あ る か ど う か beg す 検 る こ と を purpose と し た. P27 ^ < KiP1 > は, inner ear primordia cell で 発 now し て お り cell cycle を inhibit し, raised colonization differentiation を inhibit す る こ と が report さ れ て い る (Lee YS, Development 133, 2006). そ こ で ま ず, this year's は マ ウ ス cDNA ラ イ ブ ラ リ ー よ り, ク ロ ー ニ ン グ キ ッ ト を with い p27 ^ < KiP1 > を ク ロ ー ニ ン グ し, p27 ^ < KiP1 > プ ラ ス ミ ド を as し, EGFP - 9 r に p27 ^ < KiP1 > を group み 込 ん だ fusion protein (EGFP - p27 ^ < KiP 1>-9R)とEGFP-p27^<KiP1>-11Rを make と た. The protein introduction method has a lack of と て て て and the occurrence time of <s:1> た protein introduction <s:1> is が short and <s:1> <s:1> とが挙げられる とが挙げられる とが挙げられる. こ の policy と seaborne し て, Michiue ら は イ ン フ ル エ ン ザ ウ イ ル ス の ヘ マ グ ル チ ニ ン HA2 サ ブ ユ ニ ッ ト を with い た マ ク ロ ピ ノ ソ ー ム リ リ ー シ ン グ ペ プ チ ド に よ る リ リ ー シ ン グ technology を report し た (J Biol Chem, 280, 2005). The によ によ technology and the prolonged occurrence time of protein <s:1> may が となった. EGFP - 9 r に p27 ^ < KiP1 > と HA2 を group み 込 ん だ fusion protein (EGFP - HA2 - p27 ^ < KiP1 > 9 r) と EGFP HA2 -- p27 ^ < KiP1 > - 11 r を made し た. ま た, EGFP p27 ^ < KiP1 > 9 r, EGFP p27 ^ < KiP1 > - 11 r を normal マ ウ ス ear cell (E11.5) cast with し へ, inner ear primordia の が inhibit cell cycle さ れ る か を confirm す る た め の reserve be 験 と し て, EGFP - 9 r, EGFP - 11 r を import し た マ ウ ス の Tire seed head を severed し, fixed line を っ た, frozen section after を made し, immune dyeing に て inner ear primordia cells で の p27 ^ < KiP1 > の 発 を now confirmed し た.

项目成果

Protein transduction into the mouse otocyst using arginine-rich cell-penetrating peptides

• DOI: 10.1097/wnr.0b013e32834da8f8
• 发表时间: 2011-12-21
• 期刊: NEUROREPORT
• 影响因子: 1.7
• 作者: Miwa, Toru;Minoda, Ryosei;Yumoto, Eiji
• 通讯作者: Yumoto, Eiji

Protein transduction into the otocyst utilizing poly-arginine

利用聚精氨酸将蛋白质转导至耳囊

• 发表时间: 2012
• 作者: Yoshida T;Sone M;Miwa T,Minoda R,Tomizawa K,Yumoto E
• 通讯作者: Miwa T,Minoda R,Tomizawa K,Yumoto E