ヒト細胞におけるクラスターDNA損傷の修復及び変異誘導機構の解明

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放射線はDNA内に局所的に近接した2つ以上の化学的損傷を起こすと言われている。このようなDNA損傷は変異や細胞死の原因となる事が判っているが、ヒト細胞において変異や細胞死を誘発する機構は明らかではない。ヒト細胞における変異や細胞死を誘発するメカニズムを解明するため、人工的に設計した損傷入りプラスミドをヒト細胞に導入してその修復と変異発生の機構を解析する。更に、in vivoでのDNA-タンパク質相互作用によるDNA損傷の修復・変異発生を明らかにする。放射線特有のDNA損傷がヒト細胞内でどのような挙動を示すかを明らかにし、ヒトの放射線生物影響メカニズムに関する知見を得ることが本研究の目的である。動物細胞で使用できる損傷入りプラスミドを作成するには、(1)損傷の修復に必要である染色体外での複製に必要な遺伝子と(2)一本鎖DNAを作成するためのf1ファージの複製起点(f1 origin)の2つの機能を持つ鋳型プラスミドが必要である。このため、申請者は染色体外でのプラスミド複製を可能にするOriP遺伝子(Epstein-Barr Virus replication origin)とEBNA-1遺伝子(Epstein-Barr Virus replication origin and nuclear antigen)が組み込まれたpEBMulti-Neoプラスミドへのf1 origin遺伝子の導入を行った。導入には大腸菌XL.10goldを使用した。f1 origin遺伝子は大腸菌プラスミドpGEM-3zf(-)を鋳型としてPCRで増幅し、導入にはTakaraのIn fusion cloning法を使用した。その結果10個のコロニーが得ることができた