RNAに依存した遺伝暗号の進化の構造的基盤の解明

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tRNAに依存したセレノシステイン合成の多段階反応において、Ser-tRNA^<Sec>のセリン側鎖をリン酸化する酵素PSTKが選択的にtRNA^<Sec>を認識する機構を解明するため、PSTK・tRNA^<Sec>複合体の結晶構造解析を試みた。結晶化に適した均一な複合体を調製するため、mini-tRNA^<Sec>やASL-truncated tRNA^<Sec>などの数種類の変異体tRNA^<Sec>を調製し、それぞれの共結晶化を行った。その結果、幾つかの条件下で結晶化に成功し、更に結晶化条件を最適化したところ、分解能2.4Åまでの回折データを収集することができた。PSTK単独の結晶構造をサーチモデルとした分子置換法により位相決定を行い、最終的には分解能2.4Åで複合体の結晶構造を決定した。複合体の結晶構造では、C末端ドメインがN末端ドメインから約60Å離れたところまで大きく動き、tRNA^<Sec>を両側から挟むようにしてtRNAのL字構造を認識していた。C末端ドメインでは、生物種間で高度に保存されたArg199がtRNA^<Sec>に特徴的なコンパクトなDループ構造を特異的に相互作用していることが明らかになった。また、N末端ドメインのLys138、及びTyr139はtRNA^<Sec>のアクセプターステムに存在する保存性の高い塩基対G2-C71、及びC3-G70と塩基特異的な相互作用を形成していた。このようにPSTKはtRNA^<Sec>に特有の立体構造と相互作用を形成しており、これらの相互作用によってSer-tRNA^<Sec>とSer-tRNA^<Sec>を厳密に識別していることが原子分解能レベルで解明された。続いて、C末端ドメインを欠失した変異体を調製しin vitroでのリン酸化活性測定、及びin vivoでの相補性試験を行うことで、Sep-tRNA^<Sec>合成におけるN末端ドメインとC末端ドメインの役割を同定することを試みた。その結果、N末端ドメインはSep-tRNA^<Sec>合成に必要な全ての要素を持ち、N末端ドメイン単独でもSer側鎖のリン酸化は可能であることが示された。一方、C末端ドメインはtRNA^<Sec>のコア領域と強固に結合することでPSTKとSer-tRNA^<Sec>の相互作用を強め、更にSer-tRNA^<Sec>を正しい配向に固定する役割を担うことが示唆された。以上より、PSTKがセレノシステインの正確な遺伝暗号翻訳を保証する分子機構が解明された。