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変性タンパク質の可溶化技術を活用した細胞内イメージング技術の開発

利用变性蛋白溶解技术开发细胞内成像技术

基本信息

批准号：
20650070
负责人：
山田秀徳
金额：
$ 2.11万
依托单位：
Okayama University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Challenging Exploratory Research
财政年份：
2008
资助国家：
日本
起止时间：
2008 至 2009
项目状态：
已结题

项目摘要

(1) N末端特異的な蛍光標識による高精細な細胞内イメージング平成20年度に細胞内イメージングのモデルタンパク質としてN末端特異的に蛍光基を標識したβアクチンタンパク質を可逆的変性カチオン化法により高い水溶性を保持した蛍光標識プローブを調製することに成功していた。本年度はマイクロインジェクション法で細胞内への注入を試みたが、培地中で蛍光標識プローブが重合しやすく極めて困難であった。そこで蛍光標識プローブの溶解度向上に向けた諸条件を検討した結果、新規カチオン化試薬:TAP3S-Sulfonateの利用で高い溶解性が得られた。また、逆相HPLCで高純度に精製することで、純水および生理食塩水中で高い溶解度を維持できることを見出し、本手法に適した蛍光標識プローブの調製方法を確立した。(2) 細胞内分泌経路のイメージングに関する技術開発可逆的変性カチオン化により可溶化した分泌シグナル付きの前駆体の酵素タンパク質を生細胞内に導入すると、一部が培養上清中に活性構造の成熟型の酵素タンパク質が再分泌されることを酵素活性レベルで確認していたが、その収量はごく微量であった。この効率を改善するため、エンドソームから細胞質内への放出を促進する両親媒性ペプチドの併用条件を検討し、再分泌量が大幅に向上する条件を得た。さらにこの手法で回収された成熟型タンパク質を逆相HPLCを用いて高度に精製し、N末端配列を確認したところ、正しくプロセッシングを受けていることが確認され、翻訳系を伴わないpost-translational経路によるタンパク質の成熟化が可能なことを立証できた。

(1)N-terminal-specific photo-labeling of highly refined intracellular proteins has been successfully modulated in 20 years by N-terminal-specific photo-labeling of highly soluble intracellular proteins. This year, the intracellular injection method is extremely difficult to achieve. The solubility of TAP3S-Sulfonate was improved by the new method. High purity, high solubility in purified water and physiological water by reverse-phase HPLC were observed. The method for preparation of fluorescent label was established. (2)A technique for the development of reversible enzyme conversion in the endocrine pathway was developed. A part of the mature enzyme of active structure in culture supernatant was re-secreted. The enzyme activity was confirmed. To improve the rate of secretion, the conditions for promoting the release of cytosol and the conditions for increasing the amount of secretion were discussed. This method was used to analyze the maturity of the protein, to refine the protein, to confirm the N-terminal alignment, to confirm the post-translational pathway, to determine the maturity of the protein, and to demonstrate the possibility of its maturation.