化学修飾および遺伝子工学による蛋白質のフォルディング過程の解析

通过化学修饰和基因工程分析蛋白质折叠过程

• 批准号: 63580124
• 负责人: 山田 秀徳
• 金额: $ 0.83万
• 依托单位: Kyushu University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for General Scientific Research (C)
• 财政年份: 1988
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1988 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-63580124/
• 关键词: ニワトリリゾチーム; フォルディング; 化学修飾; 遺伝子工学

1.S-S結合を還元したニワトリリゾチームの活性が30分間で80%まで回復する酸化還元系(pH8、38℃)を用いて、その巻戻り過程を8M尿素ゲル電気泳動で追跡したところ、まず中間体が蓄積し、その後ネイティブリゾチームと同じ泳動度を示すバンドが現れることがわかった。中間体の生成速度はSH基の消失速度と、また後者のバンドの生成速度は活性の回復速度とよい相関を示した。2.巻戻し開始30分後反応を停止し、直接単離と2日間透析後単離の場合について、巻戻したリゾチームの性質を比較したところ、直接単離したものは安定性が低下しており、巻戻し直後のリゾチームの構造は、均一ではないことが示唆された。3.化学修飾リゾチームや大腸菌に生産された変異リゾチームを用いて同様の実験を行ったところ、-1残基目へのMetの付加やTrp62の修飾は巻戻り率を低下させ、またAla31→Valの変異では巻戻りが見られないことがわかった。最後の変異リゾチームの場合、蛋白は反応中にすべて沈澱してしまった。Trp62酸化リゾチームのNMRスペクトルは、巻戻し前後で差がみられ、Trp62は、近傍のCys64-Cys80のS-S結合の形成に関与していることが示唆された。4.色素で標識したリゾチームを用いて、色を指標に巻戻りを追跡したところ、残基番号15及び23近傍の2次構造の形成は早い段階で起こるのに対して、N末端近傍のそれは遅いことがわかった。5.上記の系で巻戻り率が低かったものを、4℃、1M尿素存在下で巻戻したところ、すべてについて巻戻り率が向上した。低温は還元リゾチームの初期構造の形成に有利に働くこと、また1M尿素は正しくない構造になったリゾチームが不溶化して系外に除かれるのを抑えることがこの原因と考えられる。一方、還元リゾチームの初期構造を有機溶媒でα-ヘリックスに強制することは、巻戻しに有効ではないこともわかった。

1. S - S combination を also yuan し た ニ ワ ト リ リ ゾ チ ー ム の で 80% between active が 30 ま reply で す る acidification and component system (pH8, 38 ℃) を い て, そ の 巻 戻 り process を 8 m urea ゲ ル electric 気 swimming で tracing し た と こ ろ, ま ず intermediates が accumulation し, そ の after ネ イ テ ィ ブ リ ゾ チ ー ム を と じ swimming with degrees in す バ ン ド Youdaoplaceholder0 present れる とがわ とがわ った った. Intermediates の generating speed は SH base の disappear と, ま た latter の バ ン ド の generating speed は active の regen と よ い phase masato を shown し た. 2. 巻 戻 し started 30 points against 応 を stop し, direct 単 from 2 day after dialysis 単 と from の occasions に つ い て, 巻 戻 し た リ ゾ チ ー ム の nature を compare し た と こ ろ, direct 単 し た も の は low stability が し て お り, 巻 戻 し straight after の リ ゾ チ ー ム は の structure, uniform で は な い こ と が in stopping さ れ た. 3. Chemical modification リ ゾ チ ー ム や coliform に production さ れ た - different リ ゾ チ ー ム を with い て with others の be 験 を line っ た と こ ろ residues, - 1 eye へ の Met の plus や Trp62 の modified は 巻 戻 り rate low を さ せ, ま た Ala31 - Val の - different で は 巻 戻 り が see ら れ な い こ と が わ か っ た. Finally, in the case of the <s:1> change リゾチ ム ム ム ム ム ム <s:1> situation, the にすべて deposition of <s:1> て まった まった まった まった in the 応 reaction of the protein. Trp62 acidification リ ゾ チ ー ム の NMR ス ペ ク ト ル は, 巻 戻 し で difference before and after が み ら れ, Trp62 は, nearly alongside の Cys64 - Cys80 の S - S combined の form に masato and し て い る こ と が in stopping さ れ た. 4. Pigment で logo し た リ ゾ チ ー ム を with い て, color を に 巻 戻 り を tracing し た と こ ろ, residue streamers, 15 and 23 nearly alongside の び 2 times tectonic の は early い Duan Jie で up こ る の に し seaborne て, N terminal near alongside の そ れ は 遅 い こ と が わ か っ た. 5. Written の is で 巻 戻 り rate が low か っ た も の を, 4 ℃, 1 m urea in the presence of で 巻 戻 し た と こ ろ, す べ て に つ い て 巻 戻 が り rate upward し た. Low-temperature は also yuan リ ゾ チ ー ム の early structure の form に favorable に 働 く こ と, ま た は is 1 m urea し く な い tectonic に な っ た リ ゾ チ ー ム が don't melt し て extrasolar に except か れ る の を え suppression る こ と が こ の reason と exam え ら れ る. One party, also yuan リ ゾ チ ー ム の early tectonic を organic solvent で alpha ヘ リ ッ ク ス に forced す る こ と は, 巻 戻 し に have sharper で は な い こ と も わ か っ た.

项目成果

Taiji Imoto.(T.E.Creighton,Editor): "Protein Function: A Practical Approach Chapter 10 Chemical Modification" IRL Press, 31 (1989)

Taiji Imoto.（T.E.Creighton，编辑）：“蛋白质功能：实用方法第 10 章化学修饰”IRL Press，31 (1989)

山田秀徳: 薬学研究の進歩-研究成果報告集. 5. 71-86 (1989)

山田英德：药物研究进展 - 研究结果报告集。5. 71-86 (1989)。