緑膿菌の多剤排出ポンプを利用した新規標的に対する抗菌剤のスクリーニング系の開発

近年、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌、多剤耐性緑膿菌に加え、多剤耐性アシネトバクターやNDM-1産生型の多剤耐性腸内細菌が出現し社会衛生上大きな問題となっている。これらの多剤耐性菌による感染症の脅威に対抗するためには新規抗菌剤の継続的な研究開発が求められている。本研究では、最近見いだされた細菌界に広く保存されているが、動物細胞にはない新規なタンパク分泌系であるTAT系を標的とするハイスループットスクリーニング系を構築するために、緑膿菌の多剤排出ポンプ(MexAB-OprM)の機能をレポーターとする新規な評価系を構築した。ジェネラルなタンパク分泌系であるSec系を介して分泌されるポンプのサブユニットであるMexAのシグナル配列を、TAT系を介して分泌される緑膿菌の病原因子であるホスホリパーゼ(PlcH)のシグナル配列と交換したキメラmexA遺伝子を構築して、染色体上のmexA遺伝子が欠損した宿主細胞に導入した。宿主はポンプが機能しないため指標薬剤であるアズトレオナム(AZT)に高感受性を示すが、キメラmexAをもつ形質転換体はAZTに対し、野生株レベルの耐性度を獲得した。さらに、このキメラmexAの機能的発現がTAT系に依存するか否か評価するために、mexA欠損株にTAT系のコンポーネントであるtatC遺伝子の破壊を導入した二重変異株を作製した。この二重変異株にキメラmexAを導入した形質転換体のAZTに対する感受性はmexA欠損株と同様高感受性であり耐性度が回復しないことから、レポーターとして用いたMexAB-OprMポンプの機能発現がTAT系に完全に依存することが明らかとなった。以上より、本研究で構築した評価系は新規標的であるTAT分泌系に対するハイスループットスクリーニング系として機能することが明らかとなった。

近年、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌、多剤耐性緑膿菌に加え、多剤耐性アシネトバクターやNDM-1産生型の多剤耐性腸内細菌が出現し社会衛生上大きな問題となっている。これらの多剤耐性菌による感染症の脅威に対抗するためには新規抗菌剤の継続的な研究開発が求められている。本研究では、最近見いだされた細菌界に広く保存されているが、動物細胞にはない新規なタンパク分泌系であるTAT系を標的とするハイスループットスクリーニング系を構築するために、緑膿菌の多剤排出ポンプ(MexAB-OprM)の機能をレポーターとする新規な評価系を構築した。ジェネラルなタンパク分泌系であるSec系を介して分泌されるポンプのサブユニットであるMexAのシグナル配列を、TAT系を介して分泌される緑膿菌の病原因子であるホスホリパーゼ(PlcH)のシグナル配列と交換したキメラmexA遺伝子を構築して、染色体上のmexA遺伝子が欠損した宿主細胞に導入した。宿主はポンプが機能しないため指標薬剤であるアズトレオナム(AZT)に高感受性を示すが、キメラmexAをもつ形質転換体はAZTに対し、野生株レベルの耐性度を獲得した。さらに、このキメラmexAの機能的発現がTAT系に依存するか否か評価するために、mexA欠損株にTAT系のコンポーネントであるtatC遺伝子の破壊を導入した二重変異株を作製した。この二重変異株にキメラmexAを導入した形質転換体のAZTに対する感受性はmexA欠損株と同様高感受性であり耐性度が回復しないことから、レポーターとして用いたMexAB-OprMポンプの機能発現がTAT系に完全に依存することが明らかとなった。以上より、本研究で構築した評価系は新規標的であるTAT分泌系に対するハイスループットスクリーニング系として機能することが明らかとなった。