パッチクランプ法による細菌細胞の多剤排出ポンプの解析

1.多剤排出ポンプの大量発現プラスミドの作成と大量発現及び活性測定昨年度構築したアラビノースプロモーターを用いた大量発現系については、通常細胞では問題なく発現させることができることから系としては問題ないことを示した。しかし巨大プロトプラストにおいて発現させると、通常細胞で見られたほどの大量発現は見られなかった。また発現量の観点から最適な条件においては細胞が十分に巨大化しておらず、このままではパッチクランプ法に適用することができないと考えられた。そこで条件検討をさらに検討した結果、いまだ最適とはいえないが、現時点では最高の条件を見出すことができたと考えられる。活性測定も行ったが現時点では細胞が小さく、極めて難しい状態である。このことは研究開始時点では全く予想できなかったことである。以上のことから更なる改善を行うためには、抜本的な発現系の改善が必須であることがわかった。そのためには巨大プロトプラスト内ではどのような遺伝子の発現が亢進されているのかを解析し、その遺伝子のプロモーター領域の塩基配列を利用すればよいという考えに至った。マイクロアレイ解析からいくつかの候補遺伝子を選ぶことができた。このような大量発現系は極めて珍しいものになると考えられる。2.新規多剤排出ポンプ遺伝子のクローニング肺炎桿菌、腸炎ビブリオ、non-01コレラ菌、緑膿菌、セラチア、黄色ブドウ球菌(MRSA)、アシネトバクターから、機能相補の面及び一次構造の類似性の面から多剤排出ポンプ遺伝子をクローニングした。合計40種程度の新規多剤排出ポンプについて現在解析を行っており、いくつかは論文発表を行った。特に黄色ブドウ球菌(MRSA)についてはゲノム配列上予想されるすべてのものについて解析を行うことができた。これは病原性細菌では初めての例である。

1.多剤排出ポンプの大量発現プラスミドの作成と大量発現及び活性測定昨年度構築したアラビノースプロモーターを用いた大量発現系については、通常細胞では問題なく発現させることができることから系としては問題ないことを示した。しかし巨大プロトプラストにおいて発現させると、通常細胞で見られたほどの大量発現は見られなかった。また発現量の観点から最適な条件においては細胞が十分に巨大化しておらず、このままではパッチクランプ法に適用することができないと考えられた。そこで条件検討をさらに検討した結果、いまだ最適とはいえないが、現時点では最高の条件を見出すことができたと考えられる。活性測定も行ったが現時点では細胞が小さく、極めて難しい状態である。このことは研究開始時点では全く予想できなかったことである。以上のことから更なる改善を行うためには、抜本的な発現系の改善が必須であることがわかった。そのためには巨大プロトプラスト内ではどのような遺伝子の発現が亢進されているのかを解析し、その遺伝子のプロモーター領域の塩基配列を利用すればよいという考えに至った。マイクロアレイ解析からいくつかの候補遺伝子を選ぶことができた。このような大量発現系は極めて珍しいものになると考えられる。2.新規多剤排出ポンプ遺伝子のクローニング肺炎桿菌、腸炎ビブリオ、non-01コレラ菌、緑膿菌、セラチア、黄色ブドウ球菌(MRSA)、アシネトバクターから、機能相補の面及び一次構造の類似性の面から多剤排出ポンプ遺伝子をクローニングした。合計40種程度の新規多剤排出ポンプについて現在解析を行っており、いくつかは論文発表を行った。特に黄色ブドウ球菌(MRSA)についてはゲノム配列上予想されるすべてのものについて解析を行うことができた。これは病原性細菌では初めての例である。