パッチクランプ法による細菌細胞の多剤排出ポンプの解析

使用膜片钳方法分析细菌细胞中的多药外排泵

• 批准号: 16790054
• 负责人: 黒田 照夫
• 金额: $ 2.3万
• 依托单位: Okayama University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
• 财政年份: 2004
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2004 至 2005
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-16790054/
• 关键词: パッチクランプ法; 多剤排出ポンプ; イオン輸送系

1.多剤排出ポンプの大量発現プラスミドの作成と大量発現及び活性測定昨年度構築したアラビノースプロモーターを用いた大量発現系については、通常細胞では問題なく発現させることができることから系としては問題ないことを示した。しかし巨大プロトプラストにおいて発現させると、通常細胞で見られたほどの大量発現は見られなかった。また発現量の観点から最適な条件においては細胞が十分に巨大化しておらず、このままではパッチクランプ法に適用することができないと考えられた。そこで条件検討をさらに検討した結果、いまだ最適とはいえないが、現時点では最高の条件を見出すことができたと考えられる。活性測定も行ったが現時点では細胞が小さく、極めて難しい状態である。このことは研究開始時点では全く予想できなかったことである。以上のことから更なる改善を行うためには、抜本的な発現系の改善が必須であることがわかった。そのためには巨大プロトプラスト内ではどのような遺伝子の発現が亢進されているのかを解析し、その遺伝子のプロモーター領域の塩基配列を利用すればよいという考えに至った。マイクロアレイ解析からいくつかの候補遺伝子を選ぶことができた。このような大量発現系は極めて珍しいものになると考えられる。2.新規多剤排出ポンプ遺伝子のクローニング肺炎桿菌、腸炎ビブリオ、non-01コレラ菌、緑膿菌、セラチア、黄色ブドウ球菌(MRSA)、アシネトバクターから、機能相補の面及び一次構造の類似性の面から多剤排出ポンプ遺伝子をクローニングした。合計40種程度の新規多剤排出ポンプについて現在解析を行っており、いくつかは論文発表を行った。特に黄色ブドウ球菌(MRSA)についてはゲノム配列上予想されるすべてのものについて解析を行うことができた。これは病原性細菌では初めての例である。

1. More than one discharge ポ ン プ の large 発 now プ ラ ス ミ ド の made と 発 now and び activity test yesterday annual construct し た ア ラ ビ ノ ー ス プ ロ モ ー タ ー を with い た large 発 now is に つ い て は, usually cell で は problem な く 発 now さ せ る こ と が で き る こ と か ら department と し て は problem な い こ と を shown し た. The <s:1> giant プロトプラストにお て て occurs in させると, the usual cells で are seen in られたほ <e:1>, and the <s:1> large occurrence is seen in られな られな った. ま た 発 amount is の 観 point か ら optimum conditions な に お い て は cells が very に gigantism し て お ら ず, こ の ま ま で は パ ッ チ ク ラ ン プ に applicable す る こ と が で き な い と exam え ら れ た. そ こ 検 で conditions for を さ ら に beg し 検 た results, い ま だ optimum と は い え な い が, current で は を の conditions show the highest す こ と が で き た と exam え ら れ る. The activity assay is conducted in ったが rows to determine the current point of で ったが cells in a が small さく or extremely めて difficult <s:1> である state である. The starting point of the study is で く quan く and で な な った った った とである とである. Above の こ と か ら more な る improve line を う た め に は, sorting this な 発 now is の must improve が で あ る こ と が わ か っ た. そ の た め に は huge プ ロ ト プ ラ ス ト within で は ど の よ う な posthumous son 伝 の 発 now が hyperthyroidism さ れ て い る の か を analytical し, そ の posthumous son 伝 の プ ロ モ ー タ ー field の salt base with column を using す れ ば よ い と い う exam え に to っ た. Youdaoplaceholder5 ら ロアレ ロアレ た analysis ら ら く く とがで 伝 伝 を を the next candidate 伝 sub を select ぶ とがで とがで た た. A large number of えられる ような ような are found to be extremely めて rare, <s:1> になると になると えられる. 2. The new rules more tonic discharge ポ ン プ posthumous son 伝 の ク ロ ー ニ ン グ klebsiella pneumoniae, enteritis ビ ブ リ オ, non - 01 コ レ ラ bacteria, pseudomonas bacteria, セ ラ チ ア, yellow ブ ド ウ aureus (MRSA), ア シ ネ ト バ ク タ ー か ら filling の surface and び, function structure の similarity の surface か ら tonic discharge more ポ ン プ heritage 伝 son を ク ロ ー ニ ン グ し た. A total of 40 degrees of multiple emissions are subject to the new regulations: ポ, プに, プに, て, て. Now, analyze the を line ってお and the く く プに プに プに った った of the paper release table を line った. Special に yellow ブ ド ウ aureus (MRSA) に つ い て は ゲ ノ ム column deserve to think さ れ る す べ て の も の に つ い て parsing line を う こ と が で き た. Youdaoplaceholder0 れ pathogenic bacteria で で primary めて <s:1> cases である.

项目成果

Gene cloning and characterization of four MATE family multidrug efflux pumps from Vibrio cholerae Non-01

霍乱弧菌 Non-01 的四个 MATE 家族多药外排泵的基因克隆和表征

• 发表时间: 2005
• 期刊: Microbiol.Immunol. 49
• 作者: Hatano;T. et al.;Begum A. et al.;Mima T.et al.;Su X-Z.et al.;Otsuka M. et al.;Kuroda T. et al.;Hatano T. et al.;Anowara Begum et al.
• 通讯作者: Anowara Begum et al.

Gene Cloning and Properties of the RND‐Type Multidrug Efflux Pumps MexPQ‐OpmE and MexMN‐OprM from Pseudomonas aeruginosa

• DOI: 10.1111/j.1348-0421.2005.tb03696.x
• 发表时间: 2005-11
• 期刊: Microbiology and Immunology
• 影响因子: 2.6
• 作者: Takehiko Mima;H. Sekiya;T. Mizushima;T. Kuroda;T. Tsuchiya

AbeM, an H+-coupled Acinetobacter baumannii multidrug efflux pump belonging to the MATE family of transporters

• DOI: 10.1128/aac.49.10.4362-4364.2005
• 发表时间: 2005-10-01
• 期刊: ANTIMICROBIAL AGENTS AND CHEMOTHERAPY
• 影响因子: 4.9
• 作者: Su, XZ;Chen, J;Tsuchiya, T
• 通讯作者: Tsuchiya, T

KmrA multidrug efflux pump from Klebsiella pneumoniae.

KmrA 肺炎克雷伯菌多药外排泵。

• 发表时间: 2006
• 期刊: Biol. Pharm. Bull. 29
• 作者: Ogawa;W. et al.
• 通讯作者: W. et al.

Multidrug resistance in Klebsiella pneumoniae MGH78578 and cloning of genes responsible for the resistance

• DOI: 10.1248/bpb.28.1505
• 发表时间: 2005-08-01
• 期刊: BIOLOGICAL & PHARMACEUTICAL BULLETIN
• 影响因子: 2
• 作者: Ogawa, W;Li, DW;Tsuchiya, T
• 通讯作者: Tsuchiya, T