パッチクランプ法による細菌細胞の多剤排出ポンプの解析

使用膜片钳方法分析细菌细胞中的多药外排泵

基本信息

批准号：
16790054
负责人：
黒田照夫
金额：
$ 2.3万
依托单位：
Okayama University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
财政年份：
2004
资助国家：
日本
起止时间：
2004 至 2005
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-16790054/
关键词：
パッチクランプ法多剤排出ポンプイオン輸送系

项目摘要

1.多剤排出ポンプの大量発現プラスミドの作成と大量発現及び活性測定昨年度構築したアラビノースプロモーターを用いた大量発現系については、通常細胞では問題なく発現させることができることから系としては問題ないことを示した。しかし巨大プロトプラストにおいて発現させると、通常細胞で見られたほどの大量発現は見られなかった。また発現量の観点から最適な条件においては細胞が十分に巨大化しておらず、このままではパッチクランプ法に適用することができないと考えられた。そこで条件検討をさらに検討した結果、いまだ最適とはいえないが、現時点では最高の条件を見出すことができたと考えられる。活性測定も行ったが現時点では細胞が小さく、極めて難しい状態である。このことは研究開始時点では全く予想できなかったことである。以上のことから更なる改善を行うためには、抜本的な発現系の改善が必須であることがわかった。そのためには巨大プロトプラスト内ではどのような遺伝子の発現が亢進されているのかを解析し、その遺伝子のプロモーター領域の塩基配列を利用すればよいという考えに至った。マイクロアレイ解析からいくつかの候補遺伝子を選ぶことができた。このような大量発現系は極めて珍しいものになると考えられる。2.新規多剤排出ポンプ遺伝子のクローニング肺炎桿菌、腸炎ビブリオ、non-01コレラ菌、緑膿菌、セラチア、黄色ブドウ球菌(MRSA)、アシネトバクターから、機能相補の面及び一次構造の類似性の面から多剤排出ポンプ遺伝子をクローニングした。合計40種程度の新規多剤排出ポンプについて現在解析を行っており、いくつかは論文発表を行った。特に黄色ブドウ球菌(MRSA)についてはゲノム配列上予想されるすべてのものについて解析を行うことができた。これは病原性細菌では初めての例である。

1。创建用于多重外排泵的大规模表达质粒，并测量大规模表达和活性。使用去年构建的阿拉伯糖启动子使用的大规模表达系统被证明没有任何问题作为系统，因为它可以在正常细胞中无问题表达。但是，当在巨型原生质体中表达时，没有观察到正常细胞中所见的高表达。此外，从表达水平的角度来看，细胞在最佳条件下的大小不够大，并且人们认为，如果贴片夹的方法持续下去，则细胞方法将不适用。因此，进一步考虑了条件，尽管它仍然不是最佳选择，但仍认为目前发现了最佳条件。还进行了活性测量，但是在这一点上，细胞很小且极其困难。在研究开始时，这是完全不可预测的。从上面的角度来看，为了进一步改善表达系统，从根本上改善表达系统至关重要。为此，我们想到的是，我们可以分析巨型原生质体中哪种基因表达增加，并使用基因启动子区域的基础序列。从微阵列分析中选择了几个候选基因。如此大的表达系统被认为极为罕见。 2。新型多饮出外排泵基因的克隆从克雷伯氏肺炎，弧菌parahaemolyticus，non-01 cholerae，pseudomonas aeruginosa，aeruginosa，erauginia，ereratia，seratia，caphyoccus aureus（mrsa and acinob and in tornob and cartholoccus and of Truncation and Inters in Cornobity Ortional and in Cornobity结构），从克雷伯氏菌肺炎，弧菌（MRSA和ACINET interiate and in-non-01）和AcIinettor contrug泵基因克隆。相似性。目前，我们正在分析总共40个新的多饮用水泵，并有一些发表的论文。特别是，对于所有预测的基因组序列，都有可能分析金黄色葡萄球菌（MRSA）。这是第一次存在致病细菌。