心水症の予防・制圧に向けた分子生態解析

心积水防治的分子生态学分析

• 批准号: 09J04584
• 负责人: 中尾 亮
• 金额: $ 1.79万
• 依托单位: Hokkaido University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2009
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2009 至 2011
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-09J04584/
• 关键词: 心水症; E. ruminantium; 遺伝子型別; MLST法; MLVA法; 次世代シーケンサー; ゲノム比較解析; ワクチン; E.ruminantium; LAMP法; 次時代シーケンサー; SNP; VNTR; 弱毒ワクチン株; 次世代シークエンサー

心水症はリケッチアの一種Ehrlichia ruminantiumが原因となるマダニ媒介性感染症である。本菌はin vitroの継代培養で弱毒化し、生菌ワクチンとして有効であることが報告されているが、その弱毒化機序は不明である。さらに、流行地では免疫原性の異なる株の混在が示唆されており、効果的なワクチン処方には野外株の遺伝子型別が必須である。そこで、本研究では次世代シーケンサーを中心としたゲノム解析技術によりワクチン株の弱毒化機序の解明と野外流行株の系統解析を目的に研究を進めた。ヤギに強毒性を示す野外分離株であるGardel株と、それを親株として得られた弱毒Gardel株を材料に、次世代シーケンサーを用いた全ゲノム配列の解読を行った。2株間のゲノム比較により、合計16箇所のゲノム差異が弱毒化に関連しうるゲノム変化として検出された。今後、発現遺伝子ならびに翻訳蛋白質の解析により、宿主への病原性を担う遺伝子の特定が可能となり、遺伝子ノックアウト技術を応用することで様々な野外流行株に対するワクチンの開発につながることが期待できる。アフリカのほぼ全域に由来する実験室分離株とウガンダの心水症流行地で採集されたエーリキア感染マダニを対象に、複数のハウスキーピング遺伝子の塩基配列に基づくMLST法により解析を行った。その結果、同一地域において地理的拘束をこえた様々な遺伝子型の混在が示された。また、複数の株間での大規模な遺伝子組換えが検出され、本菌の重要なゲノム改編メカニズムであることを明らかにした。また、より簡便・迅速な解析手法としてゲノム全域に点在する繰り返し配列をマーカーとするMLVA法を新たに開発した。既存の型別法であるPCR-RFLP法より高い多型識別能力が確認され、流行地における優勢遺伝子型群の特定が可能であり、ワクチン株を選定する上で有用な遺伝子型別法であることが示された。さらに今後、野外ワクチネーション試験において遺伝子型とワクチン効果等の臨床像の相関性を解析することで、本菌の病原性を規定する遺伝的背景の解明に活用されることが期待される。

Hydrocardiac是一种由ehrlichia iminantium引起的tick传播感染，这是一种立克。该细菌在体外亚培养中被减弱，据报道是有效的活细菌疫苗，但衰减机制尚不清楚。此外，在普遍的部位中已经提出了不同的免疫原性菌株，而现场应变基因型对于有效的疫苗制剂至关重要。因此，该研究的目的是阐明疫苗菌株衰减的机制，并使用针对下一代测序仪的基因组分析技术对现场菌株进行了针对现场菌株的系统发育分析。使用花园菌株（一种室外分离株）使用下一代测序仪对整个基因组序列进行解码，该分离株对山羊表现出高度毒力，而减毒的花园菌株作为父菌株获得。这两种菌株之间的基因组比较检测到可能与衰减有关的基因组变化，总共有16个基因组差异。将来，对表达基因和翻译蛋白的分析将鉴定出负责宿主致病性的基因，并且可以预期，基因敲除技术的应用将导致各种室外流行病的疫苗开发。我们使用MLST方法基于多个管家基因的核苷酸序列，分析了从几乎所有非洲和Elichia感染的壁虱中得出的实验室分离株。结果表明，各种基因型的混合物超过了同一区域的地理约束。此外，在多种菌株中检测到大规模的遗传重组，表明该细菌是基因组修饰的重要机制。此外，已经开发了一种新的MLVA方法，该方法将散布在整个基因组中的重复序列作为标记，作为一种更方便和快速的分析方法。已经证实，多态性识别能力高于现有的PCR-RFLP方法，并且可以在普遍位点识别主要的基因型基团，这表明它是选择疫苗菌株的有用基因分型方法。此外，预计将来，通过分析基因型与临床特征（例如疫苗疫苗试验中的疫苗作用）之间的相关性，它将用于阐明定义该细菌致病性的遗传背景。

项目成果

Development of Loop-Mediated Isothermal Amplification (LAMP) Assays for Rapid Detection of Ehrlichia ruminantium

• DOI: 10.1186/1471-2180-10-296
• 发表时间: 2010-11-19
• 期刊: BMC MICROBIOLOGY
• 影响因子: 4.2
• 作者: Nakao, Ryo;Stromdahl, Ellen Y.;Sugimoto, Chihiro
• 通讯作者: Sugimoto, Chihiro

Ehrlichia ruminantium多型解析のためのMulti-Locus Variable Number Tandem Repeat Analysis(MLVA)法開発

反刍埃里希体多态性分析的多位点可变数量串联重复分析（MLVA）方法的开发

• 发表时间: 2010
• 作者: Salim B;Bakheit MA;Salih SE;Kamau J;Nakamura I;Nakao R;Sugimoto C;中尾亮;中尾亮;中尾亮;中尾亮;中尾亮;中尾亮;中尾亮;中尾亮;中尾亮;中尾亮;中尾亮;中尾亮;中尾亮;中尾亮;Masanobu Sato;中尾亮;中尾亮;Masanobu Sato;中尾亮;佐藤正延;中尾亮;中尾亮;Masanobu Sato;中尾亮
• 通讯作者: 中尾亮

メタゲノム解析によるマダニ保有微生物叢の検索

通过宏基因组分析搜索蜱微生物群

• 发表时间: 2012
• 作者: Salim B;Bakheit MA;Salih SE;Kamau J;Nakamura I;Nakao R;Sugimoto C;中尾亮;中尾亮;中尾亮
• 通讯作者: 中尾亮

次世代シークエンサーを活用したEhrlichia ruminantium弱毒ワクチン株の全ゲノム解析

使用新一代测序仪对反刍埃里希体弱毒疫苗株进行全基因组分析

• 发表时间: 2010
• 作者: Yashiro Y.;Wan Rashidah K.;Okuda T.;Koizumi H.;中尾亮
• 通讯作者: 中尾亮

Genotying of Ehrlichia ruminantium by multiple-locus variable-number tandem-repeat analysis

通过多位点可变数量串联重复分析对反刍埃里希体进行基因分型

• 发表时间: 2011
• 作者: Funakoshi;H.;Liu;S.-C.;Kojima;H.;Ikeda;H. and Wang;J.-C.;橋本佳明・遠藤知二・市岡孝朗・兵藤不二夫・山﨑健史・坂本広道;Toshikazu Tanaka;中尾亮
• 通讯作者: 中尾亮