プロテオミクスを用いた新しいカルモデュリン標的分子の同定とシグナル伝達機構の解明

利用蛋白质组学鉴定新的钙调蛋白靶分子并阐明信号转导机制

基本信息

批准号：
10J01342
负责人：
横倉沙紀 (揺本沙紀)
金额：
$ 1.34万
依托单位：
Kagawa University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2010
资助国家：
日本
起止时间：
2010 至 2012
项目状态：
已结题

项目摘要

ca^<2+>/calmodulin-dependent protein kinase kinase (caMMK)は、多機能性calmodulin kinase (caMK)であるcaMKIおよびCaMKIV、さらには5'-AMP-actived protein kinase (AMPK)やBrain-specific kinase (BRSK1)の触媒領域の活性化ループに存在するトレオニン残基をリン酸化することにより、それらのリン酸化酵素活性を飛躍的に上昇させることが明らかとなっている。CaMKKカスケードはこれまでの研究成果より、CaMKKは多様な細胞内カルシウム依存性反応においてマスターレギュレーターとして機能することが推定されている。すなわち、CaMMKの新規リン酸化基質分子を同定することは、CaMKKを介した新しいカルシウムシグナル伝達経路の解明につながる。本研究においては、リン酸化供与体として生理的なATPではなくGTPを使用することで、新規リン酸化基質の探索に有用なCaMKKの酵素的特性について明らかにした。一方で、細胞内には数多くの内因性タンパク質リン酸化酵素が存在しているため、組織、細胞抽出溶液から標的タンパク質リン酸化酵素の生理的基質を同定することは技術的に困難である。そこで、まず初めにATP以外のヌクレオチドを用いたCaMKKのリン酸化能について検討した。組み換えCaMKKアイソフォームは、CaMKIとAMPKに対するリン酸化反応においてMg-GTPをリン酸基供与体として利用する能力を持つことが明らかとなった。また、Mg-GTPを用いる事で潜在的なCaMKK基質候補分子として、STO-609で阻害されるCa^<2+>/CaM依存的にリン酸化されるのタンパク質を検出することに成功した。

已经表明，CA^<2+>/钙调蛋白依赖性蛋白激酶激酶（CAMMK）通过苏氨酸残基的磷酸化来显着增加其磷酸化酶活性脑特异性激酶（BRSK1）。基于先前的研究结果，据估计，CAMKK级联反应在各种细胞内钙依赖性反应中充当主调节剂。也就是说，鉴定出一种新型的磷酸化底物分子用于CAMMK会导致通过CAMKK阐明一种新型的钙信号传导途径。在这项研究中，我们通过使用GTP而不是生理ATP作为磷酸化的供体来阐明CAMKK的酶促性能，可用于搜索新型磷酸化底物。另一方面，由于细胞内存在许多内源性蛋白磷酸烯酶，因此从技术上讲，从组织和细胞提取溶液中鉴定靶蛋白磷酸烯酶的生理底物是很难的。因此，首先，我们使用ATP以外的其他核苷酸研究了CAMKK的磷酸化能力。据透露，重组CAMKK同工型具有在对CAMKI和AMPK的磷酸化反应中利用MG-GTP作为磷酸盐供体的能力。此外，通过使用MG-GTP，我们成功地检测到了潜在的CAMKK底物候选分子，该蛋白质受STO-609抑制的蛋白质，该蛋白以Ca^<2+>/CAM依赖性方式磷酸化。