生細胞で二次メッセンジャー濃度を自由自在に制御する手法の開発と応用

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光応答性イノシトール三リン酸（IP3）合成酵素作成のベースとなるタンパク質として、ホスホリパーゼＣゼータ（PLCz）の構造機能相関を精査した結果、これまで活性に必須であるとされていたEFドメインを除去してもIP3産生活性を維持できることを見出した。またＸとＹドメイン間のリンカー領域で切断した分割型PLCzも、共発現させると活性が回復することを確認した。しかし、分割型PLCzのそれぞれに青色光光受容タンパク質pMagとnMag、または赤色光受容タンパク質PhyBとその結合タンパク質PIIFを付加したものを共発現させた場合、青色光または赤色光を照射した際にIP3産生の有意な増加を示す細胞内Ca2+濃度上昇応答は確認されなかった。一方、IP3分解酵素であるIP3-5-ホスファターゼA（IPP5A）の細胞膜局在化配列を除去した変異体を作成したところ、野生型にくらべPLCｚによって誘発されるCa2+濃度上昇応答に対する抑制作用が強く、細胞内IP3分解効率が高いことが示唆されたため、この変異型IPP5Aを光応答性IP3分解酵素作成のベースとして用いることとした。蛍光性IP3センサーの改良については、蛍光タンパク質CFPとYFP、およびI型IP3受容体のIP3結合部位からなるFRET型のセンサータンパク質をベースに、各蛍光タンパク質の循環置換型変異体を用いたものや、IP3結合部位内またはIP3結合部位と蛍光タンパク質間のリンカー長の異なるものを作成したところ、IP3結合部位内に15アミノ酸を付加したものでFRETシグナルのIP3依存的変化率に若干の向上か見られた。これに対し、蛍光タンパク質をTagGFP2とTagRFP, CloverとmRuby2に置き換えた場合には、IP3依存的シグナル変化がほぼ消失するという結果となった。