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生細胞で二次メッセンジャー濃度を自由自在に制御する手法の開発と応用

自由控制活细胞中第二信使浓度的方法的开发和应用

基本信息

批准号：
22K19401
负责人：
白川英樹
金额：
$ 4.16万
依托单位：
The University of Electro-Communications
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Challenging Research (Exploratory)
财政年份：
2022
资助国家：
日本
起止时间：
2022-06-30 至 2025-03-31
项目状态：
未结题

项目摘要

光応答性イノシトール三リン酸（IP3）合成酵素作成のベースとなるタンパク質として、ホスホリパーゼＣゼータ（PLCz）の構造機能相関を精査した結果、これまで活性に必須であるとされていたEFドメインを除去してもIP3産生活性を維持できることを見出した。またＸとＹドメイン間のリンカー領域で切断した分割型PLCzも、共発現させると活性が回復することを確認した。しかし、分割型PLCzのそれぞれに青色光光受容タンパク質pMagとnMag、または赤色光受容タンパク質PhyBとその結合タンパク質PIIFを付加したものを共発現させた場合、青色光または赤色光を照射した際にIP3産生の有意な増加を示す細胞内Ca2+濃度上昇応答は確認されなかった。一方、IP3分解酵素であるIP3-5-ホスファターゼA（IPP5A）の細胞膜局在化配列を除去した変異体を作成したところ、野生型にくらべPLCｚによって誘発されるCa2+濃度上昇応答に対する抑制作用が強く、細胞内IP3分解効率が高いことが示唆されたため、この変異型IPP5Aを光応答性IP3分解酵素作成のベースとして用いることとした。蛍光性IP3センサーの改良については、蛍光タンパク質CFPとYFP、およびI型IP3受容体のIP3結合部位からなるFRET型のセンサータンパク質をベースに、各蛍光タンパク質の循環置換型変異体を用いたものや、IP3結合部位内またはIP3結合部位と蛍光タンパク質間のリンカー長の異なるものを作成したところ、IP3結合部位内に15アミノ酸を付加したものでFRETシグナルのIP3依存的変化率に若干の向上か見られた。これに対し、蛍光タンパク質をTagGFP2とTagRFP, CloverとmRuby2に置き換えた場合には、IP3依存的シグナル変化がほぼ消失するという結果となった。

Photoresponsive イノシトールtrimanic acid (IP3) synthetic enzyme made of のベースとなConstruction machine of るタンパク之として, ホスホリパーゼＣゼータ (PLCz) Can be related to the results of careful inspection, activeness and must-have EFドメインをRemove the activity of IP3 and maintain it.またＸとＹドメイン间のリンカー区で Cut offしたDivided PLCzも、Ko発appearsさせるとActivityがReplyすることをConfirmationした.しかし, split type PLCzのそれぞれにcyan light-receiving material pMagとnMag, または red light-receiving material PhyBとその combined with タンパク quality PIIFをpay plus したものを同発appear させた occasion, cyan light または red light を irradiation したInternational にIP 3. The intentional increase in the concentration of Ca2+ in the cell indicates the increase in the intracellular Ca2+ concentration and is confirmed by the response. On the one hand, the cell membrane localization of IP3 degrading enzyme IP3-5-ホスファターゼA (IPP5A) Alignment and removal of allotypes and wild-type PLCs and Ca2 + The inhibitory effect of concentration increase is strong and the decomposition efficiency of intracellular IP3 is high.のベースとして is made of のベースとして using いることとした made of め, この変 isotype IPP5A, a light-responsive IP3 catalytic enzyme.荍光性 IP3センサーの Improved については, 荍光タンパクquality CFP and YFP, および Type I IP3 acceptor のIP3 binding Part of the FRET type のセンサータパクquality をベースに, each 荍光タンパク性のcyclic replacement type 剉variant いたものや, IP3 binding site internal IP3 binding site と蛍光タンパク interstitial のリンカー长のdifferent なるものを成したところ, IP 3. The change rate of 15 アミノ acid を within the binding site and the FRET シグナルのIP3 dependence is relatively high.これに対し、荍光タンパク性をTagGFP2とTagRFP, Clover's Ruby 2 settings are changed in different situations, and IP3-dependent changes are eliminated and the result is changed.