G蛋白質の迅速な活性化手法の開発

G蛋白快速激活方法的开发

基本信息

批准号：
21657035
负责人：
前濱朝彦
金额：
$ 2.05万
依托单位：
National Institute of Infectious Diseases
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Challenging Exploratory Research
财政年份：
2009
资助国家：
日本
起止时间：
2009 至 2010
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-21657035/
关键词：
シグナル伝達蛋白質発現制御

项目摘要

Gタンパク質は多彩な細胞内シグナルを制御するスイッチ分子であり、結合するグアニンヌクレオチド(GDPまたはGTP)によってその機能が制御されている。一般的にGタンパク質はGTPが結合することによって活性化型となり、下流エフェクター分子と相互作用してシグナルを伝達する。我々は前年度の研究において、NWASP-CRIB(Cdc42結合ドメイン)の両端にFKBP12およびmTOR-FRBを付加した分子が細胞内で活性化型Cdc42と結合すること、またその結合がラパマイシンの添加によって制御できることを見いだした。本年度の研究では、まずCdc42およびサプレッサー分子の精製リコンビナントタンパク質を用いて、両者間の結合をin vitroで詳細に解析する実験系を構築した。そしてサプレッサーの各ドメイン(NWASP-CRIB、FKBP12、mTOR-FRB)間のリンカー配列の至適化(長さ、フレキシビリティー)を行い、より効率的にCdc42に結合するサプレッサー分子を開発した。さらに、Cdc42の活性化によって惹起される細胞レベルでの表現型として、Erk1/2のリン酸化(MCF-7細胞)、Aktのリン酸化(MCF-7細胞)、フィロポディア形成(NIH3T3細胞)などを用い、サプレッサーの作用(ラパマイシン応答性のCdc42下流シグナルの活性化)を評価するモデル系を構築した。また、Cdc42以外の低分子量Gタンパク質に関しても、RalAに対するサプレッサー分子(Sec5-RBDの両端にFKBP12およびmTOR-FRBを付加した分子)を開発し、RalAの活性化によって引き起こされる4E-BP1のリン酸化(PC-3細胞およびMCF-7細胞)を指標として、その作用を評価するモデル系を構築した。

G蛋白是调节各种细胞内信号的开关分子，其功能受结合鸟嘌呤核苷酸（GDP或GTP）的调节。通常，G蛋白通过与GTP结合并与下游效应分子相互作用以传输信号而被激活。在上一年的研究中，我们发现将FKBP12和MTOR-FRB分子添加到NWASP-CRIB-CRIBER（CDC42结合结构域）的两端中，与细胞中的活化Cdc42结合，并且可以通过添加Rapamycin来控制结合。在今年的研究中，我们首先构建了一个实验系统，该系统使用Cdc42的纯化重组蛋白和抑制分子详细分析了两者之间的结合。然后，在抑制器的每个域（NWASP-CRIB，FKBP12，MTOR-FRB）之间优化了接头序列（长度，灵活性），以开发一种更有效地与CDC42结合的抑制分子。此外，我们构建了一个模型系统，以评估使用ERK1/2磷酸化（MCF-7细胞），AKT磷酸化（MCF-7细胞）（MCF-7细胞）和Phyllopodia形成（NIH3T 3细胞）的抑制剂（激活RAPAMYCIN反应性下游信号），AKT磷酸化（MCF-7细胞）和phyllopodia cellotiation Cdcy cycypipy。此外，对于除Cdc42以外的低分子量G蛋白，开发了RALA的抑制分子（添加到SEC5-RBD两端的RALA（分子fkbp12分子和MTOR-FRB）），并构建了一个模型系统，以使用4E-BP1的磷酸化（PC-3细胞和MCF-7）的磷酸化来评估其效应。