G蛋白質の迅速な活性化手法の開発

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Gタンパク質は多彩な細胞内シグナルを制御するスイッチ分子であり、結合するグアニンヌクレオチド(GDPまたはGTP)によってその機能が制御されている。一般的にGタンパク質はGTPが結合することによって活性化型となり、下流エフェクター分子と相互作用してシグナルを伝達する。我々は前年度の研究において、NWASP-CRIB(Cdc42結合ドメイン)の両端にFKBP12およびmTOR-FRBを付加した分子が細胞内で活性化型Cdc42と結合すること、またその結合がラパマイシンの添加によって制御できることを見いだした。本年度の研究では、まずCdc42およびサプレッサー分子の精製リコンビナントタンパク質を用いて、両者間の結合をin vitroで詳細に解析する実験系を構築した。そしてサプレッサーの各ドメイン(NWASP-CRIB、FKBP12、mTOR-FRB)間のリンカー配列の至適化(長さ、フレキシビリティー)を行い、より効率的にCdc42に結合するサプレッサー分子を開発した。さらに、Cdc42の活性化によって惹起される細胞レベルでの表現型として、Erk1/2のリン酸化(MCF-7細胞)、Aktのリン酸化(MCF-7細胞)、フィロポディア形成(NIH3T3細胞)などを用い、サプレッサーの作用(ラパマイシン応答性のCdc42下流シグナルの活性化)を評価するモデル系を構築した。また、Cdc42以外の低分子量Gタンパク質に関しても、RalAに対するサプレッサー分子(Sec5-RBDの両端にFKBP12およびmTOR-FRBを付加した分子)を開発し、RalAの活性化によって引き起こされる4E-BP1のリン酸化(PC-3細胞およびMCF-7細胞)を指標として、その作用を評価するモデル系を構築した。