FACSを利用した新規なタンパク質機能モチーフ探索法の開発

本研究では、ランダム変異導入とFACSソーティングを組み合わせて蛋白質の機能モチーフをスクリーニングする手法の開発を目的とし、癌抑制因子PICT-1を題材として、その細胞内動態(ストレス依存性の分解および核小体局在)を制御する機能モチーフの同定およびその生理的意義の解明を試みた。まずPICT-1の核小体移行を制御する機能モチーフのスクリーニングにおいては、PICT-1蛋白質上の複数部位が細胞内局在決定に関与する可能性を見いだした。さらにPICT-1のN末端側およびC末端側の双方共に核小体への局在を示すことが明らかとなり、それぞれの領域における核小体移行モチーフの同定を試みたが、本法で用いたRUBY法プローブであるPICT-1BP1が、分割したPICT-1とは結合しないことが明らかとなり、異なるプローブを用いた新規スクリーニング法が必要となった。続いて、PICT-1の分解を制御する機能モチーフのスクリーニングを行ったが、本スクリーニングにおいても少なくとも三カ所以上の複数部位が分解制御に関与する可能性を見いだした。またPICT-1をN末端側とC末端側の二つに分割した場合、どちらの領域もストレス応答性の分解を受けることが明らかとなった。さらにPICT-1分解がアポトーシス誘導剤を中心とした様々なストレス誘導剤によって起こること、またこの分解がUBE1非依存性であることを見いだした。プロテアーゼ阻害剤を用いた解析からは、この分解がMG132感受性かつカテプシンB/D非依存性であることが明らかとなった。以上の結果から、PICT-1は強いストレスによって構造的な制御を失ったプロテアソーム酵素群によって分解されている可能性が示された。

本研究では、ランダム変異導入とFACSソーティングを組み合わせて蛋白質の機能モチーフをスクリーニングする手法の開発を目的とし、癌抑制因子PICT-1を題材として、その細胞内動態(ストレス依存性の分解および核小体局在)を制御する機能モチーフの同定およびその生理的意義の解明を試みた。まずPICT-1の核小体移行を制御する機能モチーフのスクリーニングにおいては、PICT-1蛋白質上の複数部位が細胞内局在決定に関与する可能性を見いだした。さらにPICT-1のN末端側およびC末端側の双方共に核小体への局在を示すことが明らかとなり、それぞれの領域における核小体移行モチーフの同定を試みたが、本法で用いたRUBY法プローブであるPICT-1BP1が、分割したPICT-1とは結合しないことが明らかとなり、異なるプローブを用いた新規スクリーニング法が必要となった。続いて、PICT-1の分解を制御する機能モチーフのスクリーニングを行ったが、本スクリーニングにおいても少なくとも三カ所以上の複数部位が分解制御に関与する可能性を見いだした。またPICT-1をN末端側とC末端側の二つに分割した場合、どちらの領域もストレス応答性の分解を受けることが明らかとなった。さらにPICT-1分解がアポトーシス誘導剤を中心とした様々なストレス誘導剤によって起こること、またこの分解がUBE1非依存性であることを見いだした。プロテアーゼ阻害剤を用いた解析からは、この分解がMG132感受性かつカテプシンB/D非依存性であることが明らかとなった。以上の結果から、PICT-1は強いストレスによって構造的な制御を失ったプロテアソーム酵素群によって分解されている可能性が示された。