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細胞の運命転換における選択的スプライシング制御機構の解析

细胞命运转换中的选择性剪接控制机制分析

基本信息

批准号：
12J07004
负责人：
太田翔
金额：
$ 1.15万
依托单位：
Kyoto University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2012
资助国家：
日本
起止时间：
2012 至 2013
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-12J07004/
关键词：
体細胞初期化選択的スプライシング RNA結合タンパク質

项目摘要

本研究は、体細胞初期化過程における選択的スプライシングの制御機構を明らかにることを目的とする。本年度はまず、体細胞初期化における選択的スプライシングの変化とエピジェネティック修飾との関連を、報告されているChIP-seqのデータを用いて解析した。しかしながら、選択的スプライシングの変化と明らかな相関のあるエピジェネティック修飾を見つけることはできなかった。続いて、去年度確立したノックダウンスクリーニングの実験による解析をさらに推し進めた。siRNAを用いたノックダウンスクリーニングとハイスループットな定量的RT-PCR法を用いて体系的に解析を行った結果、多能性幹細胞において選択的スプライシングを制御するRNA結合タンパク質をコードする遺伝子を同定した。これらのRNA結合タンパク質についてshRNAを設計し、体細胞初期化過程におけるノックダウン実験を行った。多能性関連遺伝子の発現を指標に体細胞初期化効率を評価したところ、U2af1とSrsfという二つのRNA結合タンパク質の発現抑制により体細胞初期化効率が減少することが分かった。これらの結果は、体細胞初期化過程においてU2af1とSrsfによる選択的スプライシング制御が重要な役割を果たしていることを示唆する。次に、これらのRNA結合タンパク質が前駆体mRNAに直接結合してスプライシング制御を行っているのか、どういった遺伝子のスプライシングを制御しているのかを解析するためにCLIP法による実験系の確立を試みた。報告されている研究の中で使用されているCLIP法では放射性同位体を用いている。本研究では放射性同位体を用いない簡便な手法の確立を目指した。次世代シーケンサーや定量的RT-PCRを用いたRNA結合タンパク質に結合しているRNAの解析は今後の課題である。

The aim of this study is to clarify the regulatory mechanism of somatic cell initiation. This year, the analysis of ChIP-seq's application in the process of somatic cell initialization was carried out.しかしながら、选択的スプライシングの変化と明らかな相关のあるエピジェネティック修饰を见つけることはできなかった。In the past year, the establishment of the new system has been promoted. The analysis results of siRNA using quantitative RT-PCR method in the system, the control of RNA-binding protein in pluripotent stem cells, and the determination of RNA binding protein. This RNA binding protein is designed to be used in the initiation of somatic cells. An indicator of pluripotency related gene expression is the efficiency of somatic cell initiation, which is evaluated by U2af1 and Srsf. The result is that the selection of the cell initiation process is important for the control of cell growth. Secondly, we are trying to establish a practical system for the CLIP method by analyzing how these RNA-binding proteins directly bind to the precursor mRNA and control the protein sequence of the gene. The CLIP method is used in the study of radioactive isotopes. This study is aimed at establishing a simple method for the use of radioactive isotopes. The next generation of quantitative RT-PCR is expected to be used for RNA binding and qualitative analysis.