細胞の運命転換における選択的スプライシング制御機構の解析

本研究は、体細胞初期化過程における選択的スプライシングの制御機構を明らかにることを目的とする。本年度はまず、体細胞初期化における選択的スプライシングの変化とエピジェネティック修飾との関連を、報告されているChIP-seqのデータを用いて解析した。しかしながら、選択的スプライシングの変化と明らかな相関のあるエピジェネティック修飾を見つけることはできなかった。続いて、去年度確立したノックダウンスクリーニングの実験による解析をさらに推し進めた。siRNAを用いたノックダウンスクリーニングとハイスループットな定量的RT-PCR法を用いて体系的に解析を行った結果、多能性幹細胞において選択的スプライシングを制御するRNA結合タンパク質をコードする遺伝子を同定した。これらのRNA結合タンパク質についてshRNAを設計し、体細胞初期化過程におけるノックダウン実験を行った。多能性関連遺伝子の発現を指標に体細胞初期化効率を評価したところ、U2af1とSrsfという二つのRNA結合タンパク質の発現抑制により体細胞初期化効率が減少することが分かった。これらの結果は、体細胞初期化過程においてU2af1とSrsfによる選択的スプライシング制御が重要な役割を果たしていることを示唆する。次に、これらのRNA結合タンパク質が前駆体mRNAに直接結合してスプライシング制御を行っているのか、どういった遺伝子のスプライシングを制御しているのかを解析するためにCLIP法による実験系の確立を試みた。報告されている研究の中で使用されているCLIP法では放射性同位体を用いている。本研究では放射性同位体を用いない簡便な手法の確立を目指した。次世代シーケンサーや定量的RT-PCRを用いたRNA結合タンパク質に結合しているRNAの解析は今後の課題である。

本研究は、体細胞初期化過程における選択的スプライシングの制御機構を明らかにることを目的とする。本年度はまず、体細胞初期化における選択的スプライシングの変化とエピジェネティック修飾との関連を、報告されているChIP-seqのデータを用いて解析した。しかしながら、選択的スプライシングの変化と明らかな相関のあるエピジェネティック修飾を見つけることはできなかった。続いて、去年度確立したノックダウンスクリーニングの実験による解析をさらに推し進めた。siRNAを用いたノックダウンスクリーニングとハイスループットな定量的RT-PCR法を用いて体系的に解析を行った結果、多能性幹細胞において選択的スプライシングを制御するRNA結合タンパク質をコードする遺伝子を同定した。これらのRNA結合タンパク質についてshRNAを設計し、体細胞初期化過程におけるノックダウン実験を行った。多能性関連遺伝子の発現を指標に体細胞初期化効率を評価したところ、U2af1とSrsfという二つのRNA結合タンパク質の発現抑制により体細胞初期化効率が減少することが分かった。これらの結果は、体細胞初期化過程においてU2af1とSrsfによる選択的スプライシング制御が重要な役割を果たしていることを示唆する。次に、これらのRNA結合タンパク質が前駆体mRNAに直接結合してスプライシング制御を行っているのか、どういった遺伝子のスプライシングを制御しているのかを解析するためにCLIP法による実験系の確立を試みた。報告されている研究の中で使用されているCLIP法では放射性同位体を用いている。本研究では放射性同位体を用いない簡便な手法の確立を目指した。次世代シーケンサーや定量的RT-PCRを用いたRNA結合タンパク質に結合しているRNAの解析は今後の課題である。