発現プロファイル解析による植物共生菌分泌タンパク質の共生成立における機能の解明

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1. ProAに発現制御を受ける遺伝子群の機能解析先に、Epichloё festucaeにおいて宿主植物との共生確立に必須であるZn(II)2Cys6タイプの転写制御因子をコードする遺伝子ProAを同定した。本研究では、E. festucaeにおいて、ProAがどのように宿主植物との共生確立に関わっているかを明らかにするため、野生株およびproA変異株感染サンプルのRNA-seqを実施した。本年度は、さらに、E. festucae野生株の培養時の発現プロファイルデータを得た。E. festucaeゲノム上の9,350遺伝子の発現パターンから、宿主植物感染時に発現が誘導され、proA変異により発現が顕著に抑制される191遺伝子を特定した。それらのうち58遺伝子にコードされるタンパク質は、N末端に分泌シグナルを有していた。これらのうち、25遺伝子は全長が200アミノ酸以下のタンパク質をコードしており、核輸送シグナル配列を有するものも複数見出された。これら25遺伝子のうち10遺伝子について変異株を作成したところ、proA変異株と同様に宿主植物の矮化・枯死を引き起こす変異株が得られた。2. ProAに直接発現制御を受ける遺伝子群の同定ProAタンパク質が、直接結合するプロモーター配列の回収（ChIP）はすでに成功している。そこで、1の解析により同定された分泌タンパク質をコードする遺伝子群について、ChIP-PCR実験を実施したところ、複数の遺伝子群のプロモーター領域が高濃度で検出され、これら遺伝子群がProAタンパク質に直接制御される可能性が示された。しかしながら、次世代シークエンサーを用いた網羅的解析に必要なDNA量が回収できていないため、ChIP法の改善と並行して、本年度は、in vitroで結合反応を行うSELEX法を用い、プロモーター配列の回収を行った。SELEX法に必要なゲノムライブラリーを作成し、ProAタンパク質とタグとなるMBPとの融合タンパク質を用いて、ProA結合性プロモーター配列を回収した。