Development of recombinant cell lines dying upon single action potentialoccurrence and the new screening system for compounds acting on ion channels

开发单次动作电位发生时死亡的重组细胞系以及作用于离子通道的化合物的新筛选系统

• 批准号: 23659046
• 负责人: IMAIZUMI Yuji
• 金额: $ 2.41万
• 依托单位: Nagoya City University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Challenging Exploratory Research
• 财政年份: 2011
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2011 至 2012
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-23659046/
• 关键词: イオンチャネル; 活動電位; 細胞死; 創薬標的分子; 高効率探索系; 薬理; 変異ナトリウムチャネル; ナトリウムチャネル; イオンチャネル標的創薬

To provide a simple but high throughput screening method for compounds acting on ion channels, a new recombinant cell line, in which single action potential (AP) induced cell death, was produced by gene transfection. Mutated human cardiac Na^+channel Nav1.5 (IFM/Q3), which shows extremely slow inactivation, and wild type inward rectifier K^+channel, Kir2.1 were stably co-expressed in HEK293 cells (IFM/Q3+K_<ir>2.1). In IFM/Q3+K_<ir>2.1, application of single electrical stimulation (ES) elicited a long AP lasting over 30 s and led cells to die by over 70 %, while HEK293 co-transfected with wild type Nav1.5 and K_<ir>2.1 fully survived. The additional expression of hERG K+channels in IFM/Q3+K_<ir>2.1 shortened the duration of evoked AP and, thereby, markedly reduced the cell death. The treatment of the cells with nifekalant, E-4031, cisapride, terfenadine and verapamil, hERG channel inhibitors, recovered the prolonged AP and dose-dependently facilitated cell death upon ES. Results indica … More te the high utility of this cell system for hERG K+channel safety assay. Moreover, to develop a screening system for blockers of voltage-gated Kv1.3 and Kv1.5 channels, new cell lines co-expressing IMF/Q3, K_<ir>2.1 and Kv1.3 or Kv1.5 were introduced as IFM/Q3+K_<ir>+Kv1.3 and IFM/Q3+K_<ir>+Kv1.5, respectively. Co-expression of Kv1.3 or Kv1.5 to IFM/Q3+K_<ir> shortened the evoked APs and prevented the cell death. In the presence of margatoxin, a selective Kv1.3 blocker, ES induced the cell death in IFM/Q3+K_<ir>+Kv1.3, but not in IFM/Q3+K_<ir>+Kv1.5. In the presence of 4-aminopyridine, a non-selective Kv channel blocker, ES application elicited cell death in both cell lines. The IC50s of acacetin, a Kv1.5 blocker, and citalopram, a 5-HT uptake-inhibitor, in IFM/Q3+K_<ir>+Kv1.3 were almost identical to those in IFM/Q3+K_<ir>+Kv1.5. It was, thereby, found that acacetin and citalopram block both Kv1.3 and Kv1.5 without significant selectivity. The new cell lines for hERG, Kv1.3 or Kv1.5 channel inhibition assay fit to the high-throughput screening because of its simplicity, accuracy and high cost-performance. Less

为了提供一种简单但高通量的筛选作用于离子通道的化合物的方法，通过基因转染法获得了一种新的重组细胞系，在该细胞系中，单动作电位(AP)诱导了细胞死亡。突变的人心肌钠离子通道NaV1.5(IFM/Q3)和野生型内向整流钾通道Kir2.1在HEK293细胞(IFM/Q3+K_&lt；IR&gt；2.1)中稳定共表达。在IFM/Q3+K&lt；IR&gt；2.1中，单次电刺激(ES)可诱导30个以上的长AP，并导致细胞死亡70%以上，而野生型NaV1.5与K&lt；IR&gt；2.1共转染的HEK293细胞完全存活。在IFM/Q3+K&lt；IR&Gt；2.1中额外表达Herg K+通道可缩短诱发AP的持续时间，从而显著减少细胞死亡。HERG通道阻断剂硝苯卡兰、E-4031、西沙必利、特非那定和维拉帕米可使延长的AP恢复，并呈剂量依赖性地促进ES细胞死亡。结果Indica…进一步证明了该细胞系统在HERG K+通道安全检测中的高实用性。此外，为了建立电压门控Kv1.3和Kv1.5通道阻滞剂的筛选系统，引入了共表达IMF/Q3、K_&lt；IR&gt；2.1和Kv1.3或Kv1.5的新细胞系IFM/Q3+K_&lt；IR&gt；+Kv1.3和IFM/Q3+K_&lt；IR&gt；+Kv1.5。Kv1.3或Kv1.5共表达于IFM/Q3+K&gt；IR和Gt；可缩短诱发的AP，防止细胞死亡。ES可诱导IFM/Q3+K+Kv1.3细胞死亡，但不能诱导IFM/Q3+K&gt；IR+Kv1.5细胞死亡。在非选择性Kv通道阻滞剂4-氨基吡啶存在的情况下，ES诱导两种细胞系的细胞死亡。在IFM/Q3+K+Kv1.3和IFM/Q3+K_&lt；IR&gt；+Kv1.5中，Kv1.5阻滞剂Aacacetin和5-羟色胺摄取抑制剂西酞普兰的IC50值与IFM/Q3+K_&gt；IR&gt；+Kv1.5几乎相同。结果发现，金合欢素和西酞普兰对Kv1.3和Kv1.5均有阻断作用，且无明显选择性。用于HERG、Kv1.3或Kv1.5通道抑制实验的新细胞系，由于其简单、准确和高性价比，适合于高通量筛选。较少

项目成果

平滑筋臓器におけるCa^<2+>クロックとペースメーキング機能

平滑肌器官中的 Ca^<2+> 时钟和起搏功能

• 发表时间: 2012
• 作者: 朴懿;羽田沙緒里;鈴木利治;Takenori Tomohiro and Yasumaru Hatanaka;今泉祐治
• 通讯作者: 今泉祐治

腎動脈結紮高血圧モデルマウスにおける内向き整流性 K+チャネル(K_<ir>2.1)の機能変化 IP_3 シグナルの電位依存性と Ca^<2+>依存性

肾动脉结扎高血压模型小鼠内向整流K+通道(K_<ir>2.1)功能变化IP_3信号的电压依赖性和Ca^<2+>依赖性

• 发表时间: 2012
• 作者: 藤井将人;他;山村寿男;鬼頭宏彰;松木克仁;藤井将人;鈴木良明;大羽輝弥;大城隼也;伊奈山宗典;清田恵子;鬼頭宏彰;鬼頭宏彰;伊奈山宗典;大城隼也;鈴木良明;藤井将人;松木克仁;鬼頭宏彰;山村寿男;大城隼也;鈴木良明;鈴木良明;松木克仁;鈴木良明;清田恵子;藤井将人;大羽輝弥;伊奈山宗典;鈴木良明
• 通讯作者: 鈴木良明

前立腺肥大モデルラットの移植排尿生殖洞における大コンダクタンスカルシウム活性化カリウムチャネル発現

前列腺肥大模型大鼠移植泌尿生殖窦中大电导钙激活钾通道的表达

• 发表时间: 2012
• 作者: Huanjie Guo;Huanxin Zhao;Yuichiro Kanno;Wei Li;Yanling Mu;Xinzhu Kuang;Yoshio Inouye;Kazuo Koike;Haipeng Jiang;Hong Bai;中川公恵;丹羽里実
• 通讯作者: 丹羽里実

脳血管内皮細胞における内向き整流性K+（Kir2.1）チャネルを介した細胞死制御機構の解明

阐明脑血管内皮细胞内向整流K+（Kir2.1）通道介导的细胞死亡控制机制

• 发表时间: 2011
• 作者: 小西守周;伊藤信行;中川公恵;鬼頭宏彰
• 通讯作者: 鬼頭宏彰

マウス非妊娠・妊娠における3型リアノジン受容体の発現と機能変化

非孕鼠和孕鼠3型兰尼定受体的表达及功能变化

• 发表时间: 2011
• 作者: 黒田拓也;安田智;草川森士;鈴木和博;川真田伸;佐藤陽治;福与由香;田沼 信明，菅野 裕一朗，井上 義雄;川田浩一，家雲高哲，齋藤僚，金子雅幸，野村靖幸，大熊康修;Kuroda Takuya;松木克仁
• 通讯作者: 松木克仁