1分子計測法によるRasの情報伝達機構の解析

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細胞増殖のための情報伝達G蛋白質Rasの反応を1分子計測し、解析することにより、細胞増殖信号の伝達機構を解明することを目的として研究を行った。RasとRaf-1との相互作用、上皮増殖因子の刺激に伴うRasの細胞内分布変化を計測しその分子機構を明らかにすることを具体的な課題とし、以下の結果を得た。1)全反射蛍光顕微鏡を用いて、蛍光色素1分子で標識した上皮成長因子1分子を生きている細胞中で可視化する方法を開発した。細胞膜に結合した輝点ひとつひとつの光褪色が1段階で起こること、輝点の蛍光強度分布が量子化されていることから、これらの輝点が蛍光色素1分子であることが示された。2)この方法を応用して、上皮成長因子(EGF)受容体の細胞膜での局在・運動・2量体化・自己リン酸化反応を1分子計測した。EGF受容体の2量体化反応を追跡することによって、細胞膜上の2つのEGF受容体が衝突によって2量体を作ることはまれであり、多くの2量体は溶液中のCy3-EGFが細胞膜のCy3-EGFとEGF受容体の複合体の上に直接結合して形成されることがわかった。これは、EGFの結合した受容体と結合していない受容体が、2番目のEGFの結合以前に、何らかの複合体を形成している可能性を示している。3)RasおよびRasの下流に位置するリン酸化酵素Raf-1と、緑色蛍光蛋白質(GFP)の融合遺伝子を構築し、培養上皮細胞に発現させてRasの活性化によるRaf-1の細胞内局在変化を実時間画像化した。Raf-1の膜移行が拡散過程によっていること、Rasの濃度分布と活性化の程度は必ずしも対応していないことが示された。4)細胞内でGFPとRas,Raf-1の融合蛋白質を1分子可視化した。Ras,活性化したRaf-1は共に細胞膜下で拡散運動していることがわかった。