ＤＮＡ鎖間架橋除去に働くＦＡＮ１ヌクレアーゼの損傷塩基対除去機構

本研究は、FAN1ヌクレアーゼによるDNA鎖間架橋(Interstrand crosslink: ICL)の除去機構を明らかにすることを目的としている。ICLの除去は、ICL修復不全によってもたらされるファンコニ貧血の病体解明だけでなく、ゲノムの安定性の理解にも繋がる重要な機構である。ICLの修復は、DNA複製と共役して行われる。DNA複製がICLによって停止すると、5´-flap構造を有するDNA基質が形成される。FAN1ヌクレアーゼは、この構造を特異的に認識し、架橋された塩基対を切り出す。一方で、5´-flap構造の単鎖DNA領域には、RPAと呼ばれる単鎖DNA結合タンパク質が迅速に集積することが明らかになっている。これらのことは、生体内でFAN1は、RPAが結合した5´-flap構造を認識してDNA切断を行う必要があることを意味している。RPAが結合した基質上でのFAN1によるDNA切断活性の解析は、ICL修復機構の理解に重要な知見を与えるものであるが、現在までその解析は行われてこなかった。そこで、全長ヒトFAN1の新規精製系およびFAN1のヌクレアーゼ活性を評価する試験管内再構成系を確立し、解析を行った。その結果、まず大腸菌発現系を用いてFAN1を高純度かつ大量に精製することに成功した。さらに、調製したFAN1を用いて、RPAが結合した5´-flap DNA基質に対するヌクレアーゼ活性を評価したところ、この基質に対してもFAN1は効率良くDNA切断を導入できることを明らかにした。以上のことから、FAN1は、5´-flap構造の二重鎖DNA領域に結合し、単鎖DNA領域に結合したRPAと立体障害を起こすことなく、DNA鎖の正確な切断を行うことが明らかになった。

本研究は、FAN1ヌクレアーゼによるDNA鎖間架橋(Interstrand crosslink: ICL)の除去機構を明らかにすることを目的としている。ICLの除去は、ICL修復不全によってもたらされるファンコニ貧血の病体解明だけでなく、ゲノムの安定性の理解にも繋がる重要な機構である。ICLの修復は、DNA複製と共役して行われる。DNA複製がICLによって停止すると、5´-flap構造を有するDNA基質が形成される。FAN1ヌクレアーゼは、この構造を特異的に認識し、架橋された塩基対を切り出す。一方で、5´-flap構造の単鎖DNA領域には、RPAと呼ばれる単鎖DNA結合タンパク質が迅速に集積することが明らかになっている。これらのことは、生体内でFAN1は、RPAが結合した5´-flap構造を認識してDNA切断を行う必要があることを意味している。RPAが結合した基質上でのFAN1によるDNA切断活性の解析は、ICL修復機構の理解に重要な知見を与えるものであるが、現在までその解析は行われてこなかった。そこで、全長ヒトFAN1の新規精製系およびFAN1のヌクレアーゼ活性を評価する試験管内再構成系を確立し、解析を行った。その結果、まず大腸菌発現系を用いてFAN1を高純度かつ大量に精製することに成功した。さらに、調製したFAN1を用いて、RPAが結合した5´-flap DNA基質に対するヌクレアーゼ活性を評価したところ、この基質に対してもFAN1は効率良くDNA切断を導入できることを明らかにした。以上のことから、FAN1は、5´-flap構造の二重鎖DNA領域に結合し、単鎖DNA領域に結合したRPAと立体障害を起こすことなく、DNA鎖の正確な切断を行うことが明らかになった。