ＤＮＡ鎖間架橋除去に働くＦＡＮ１ヌクレアーゼの損傷塩基対除去機構

FAN1 核酸酶的受损碱基对去除机制可去除 DNA 链间交联

• 批准号: 14J06948
• 负责人: 高橋 大介
• 金额: $ 1.41万
• 依托单位: Waseda University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2014
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2014-04-25 至 2016-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-14J06948/
• 关键词: FAN1ヌクレアーゼ; DNA鎖間架橋修復; ファンコニ貧血; DNA鎖間架橋; FANCI-FANCD2(ID)複合体

本研究は、FAN1ヌクレアーゼによるDNA鎖間架橋(Interstrand crosslink: ICL)の除去機構を明らかにすることを目的としている。ICLの除去は、ICL修復不全によってもたらされるファンコニ貧血の病体解明だけでなく、ゲノムの安定性の理解にも繋がる重要な機構である。ICLの修復は、DNA複製と共役して行われる。DNA複製がICLによって停止すると、5´-flap構造を有するDNA基質が形成される。FAN1ヌクレアーゼは、この構造を特異的に認識し、架橋された塩基対を切り出す。一方で、5´-flap構造の単鎖DNA領域には、RPAと呼ばれる単鎖DNA結合タンパク質が迅速に集積することが明らかになっている。これらのことは、生体内でFAN1は、RPAが結合した5´-flap構造を認識してDNA切断を行う必要があることを意味している。RPAが結合した基質上でのFAN1によるDNA切断活性の解析は、ICL修復機構の理解に重要な知見を与えるものであるが、現在までその解析は行われてこなかった。そこで、全長ヒトFAN1の新規精製系およびFAN1のヌクレアーゼ活性を評価する試験管内再構成系を確立し、解析を行った。その結果、まず大腸菌発現系を用いてFAN1を高純度かつ大量に精製することに成功した。さらに、調製したFAN1を用いて、RPAが結合した5´-flap DNA基質に対するヌクレアーゼ活性を評価したところ、この基質に対してもFAN1は効率良くDNA切断を導入できることを明らかにした。以上のことから、FAN1は、5´-flap構造の二重鎖DNA領域に結合し、単鎖DNA領域に結合したRPAと立体障害を起こすことなく、DNA鎖の正確な切断を行うことが明らかになった。

这项研究旨在阐明FAN1核酸酶去除DNA间链交联（ICL）的机制。去除ICL是一种重要的机制，不仅阐明了由ICL失败引起的Fanconi贫血的病理，而且还有助于理解基因组的稳定性。 ICL修复与DNA复制结合进行。当ICL停止DNA复制时，形成具有5'-Flap结构的DNA底物。 FAN1核酸酶特异性识别该结构并切除交联的基础对。另一方面，已经揭示了称为RPA的单链DNA结合蛋白迅速积聚在5'-Flap结构的单链DNA区域中。这些结果表明，体内FAN1必须识别RPA结合并执行DNA裂解的5'-FLAP结构。 FAN1对RPA结合的底物对DNA裂解活性的分析提供了重要的见解，以了解理解ICL修复的机制，但迄今尚未进行分析。因此，建立并分析了一个全长人类FAN1的新型纯化系统和用于评估FAN1核酸酶活性的体外重建系统。结果，首先使用大肠杆菌表达系统在高纯度和大量上成功纯化了FAN1。此外，当使用准备好的FAN1评估结合RPA的5'-FLAP DNA底物的核酸酶活性时，据揭示了FAN1也可以有效地将DNA裂解引入该底物。从上面可以揭示出FAN1与5'-FLAP结构的双链DNA区域结合，并准确切割DNA链而不会引起与单链DNA区域结合的RPA的空间障碍。

项目成果

Involvement of FAN1 nuclease in interstrand crosslink repair

FAN1 核酸酶参与链间交联修复

• 发表时间: 2014
• 作者: 高橋大介;佐藤浩一;平山恵美子;高田穣;胡桃坂仁志
• 通讯作者: 胡桃坂仁志