スクアレン修飾酵素のスクリーニング法の開発と機能改良への応用

角鲨烯修饰酶的筛选方法开发及其在功能改善中的应用

• 批准号: 15J07486
• 负责人: 李 伶
• 金额: $ 1.79万
• 依托单位: Chiba University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2015
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2015-04-24 至 2018-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-15J07486/
• 关键词: テルペノイド; スクアレン; 非天然スクアレン; 進化工学; 色スクリーニング; 生合成; ボトリオコッセン; カロテノイド

トリテルペノイドはC30の分子骨格を持つイソプレノイドの総称であり，カロテノイド，ステロイド，という巨大な代謝物類のファミリーに加え，最近では，微細藻類などが合成するボトリオコッセンが加わり，その多様性の創出メカニズムに注目が集まっている。それぞれの生合成酵素の活性をスクリーニングする方法を開発し，それを用いて，それぞれの酵素の反応特異性を改良することが，本研究の最初の目的である。申請者は，ステロイド類の前駆体であるスクアレンを可視化する手法を開発した。本研究では，このスクリーニング法を用いて，様々なテルペノイド合成酵素の機能を改良することを目指した。昨年度までは，スクアレン合成酵素の近縁であるボトリオコッセン合成酵素（SSL1，SSL3）の細胞内活性の向上およびサイズ特異性改変を行い，C35,C40,C45非天然ボトリオコッセンの生合成を世界で初めて成功させることができた。さらに，反応ポケットに30個のアミノ酸置換を導入し，進化の過程でSSL3が失った前段の反応（2FPP→PSPP）を回復する変異体を得ることに成功した。また，スクアレン環化酵素(SHC )のスクリーニング系の構築に成功した。今年度は，スクアレン環化酵素(SHC )のスクリーニング系を用いて，中等度好熱好酸菌Alicyclobacillus acidocaldarius由来のスクアレン環化酵素(SHC)の37℃における大腸菌内活性が向上したSHC変異体を取得した。また，C35, C40, C50非天然スクアレン骨格を大腸菌内で選択的に生合成することができ，それそれの骨格合成経路にSHCを追加発現させることにより，C35, C40骨格の環化産物を大腸菌内生合成することができた。また，C35スクアレンの細胞内蓄積を可視化する経路を構築できた。

ト リ テ ル ペ ノ イ ド は C30 の molecular skeleton を hold つ イ ソ プ レ ノ イ ド の 総 said で あ り, カ ロ テ ノ イ ド, ス テ ロ イ ド, と い う な metabolites such huge の フ ァ ミ リ ー に え, recently で は, micro algae な ど が synthetic す る ボ ト リ オ コ ッ セ ン が plus わ り, そ の multiple others の hit メ カ ニ ズ ム に attention が set ま っ て い る. の そ れ ぞ れ の biosynthesis enzyme activity を ス ク リ ー ニ ン グ す る method を open 発 し, そ れ を with い て, そ れ ぞ れ の anti 応 の enzyme specificity modified す を る こ と が, this study original purpose の の で あ る. Applicants は, ス テ ロ イ ド 駆 body before class の で あ る ス ク ア レ ン を visualization す る gimmick を open 発 し た. This study で は, こ の ス ク リ ー ニ ン を グ method with い て, others 々 な テ ル ペ ノ イ ド synthetic enzyme の function improved を す る こ と を refers し た. Yesterday annual ま で は, ス ク ア レ ン synthetic enzyme の nearly try で あ る ボ ト リ オ コ ッ セ ン synthetic enzyme (SSL1, SSL3) の cell activity の upward お よ び サ イ ズ specificity change - を い, C35, C40, C45 unnatural ボ ト リ オ コ ッ セ ン の biosynthesis を め the early で て successful さ せ る こ と が で き た. さ ら に, anti 応 ポ ケ ッ ト に 30 の ア ミ ノ acid replacement を import し, evolution process of の で SSL3 が lost っ の た delivering against 応 reply (2 FPP - PSPP) を す る - variant を must る こ と に successful し た. ま た, ス ク ア レ ン cyclization enzyme (SHC ") の ス ク リ ー ニ ン グ built is の に success し た. This year, ス, ス, アレ, アレ cyclooxycyclase (SHC) ス ス, リ, ニ, グ, グ is used in を with て て. The moderate thermophilic and acidophilic Alicyclobacillus acidocaldarius was obtained from ス アレ アレ <s:1> cycase (SHC) <s:1> at 37 ° c における E. coli activity が upward <s:1> たSHC variant を た. ま た, C35, C40, C50 unnatural ス ク ア レ ン bone を coliform in で す sentaku に raw synthesis る こ と が で き, そ れ そ れ の bone synthesis 経 road に SHC "を additional 発 now さ せ る こ と に よ り, C35, C40 bone の cyclization product を coliform endogenous synthesis す る こ と が で き た. Youdaoplaceholder0, C35ス アレ アレ ス <s:1> <s:1> intracellular accumulation を visualization する pathway を construction で た た た.

项目成果

ボトリオコッセン生合成経路における細胞内活性の改良方法と該方法で得られる酵素変異体

一种提高葡萄球菌生物合成途径细胞内活性的方法以及该方法获得的酶变体

• 发表时间: 2017

非天然C50カロテノイドのε環化経路の構築

非天然C50类胡萝卜素ε环化途径的构建

• 发表时间: 2017
• 作者: 大谷悠介;李伶;古林真衣子;河合(野間)繁子;斎藤恭一;眞 岡孝至;梅野太輔
• 通讯作者: 梅野太輔

カロテノイド生合成における「リコペルセン経路」の構築

类胡萝卜素生物合成“番茄途径”的构建

• 发表时间: 2017
• 作者: 梅野太輔;李伶;古林真衣子;河合(野間)繁子;斎藤恭一;眞岡孝至
• 通讯作者: 眞岡孝至

Exploring non-natural“carotenoid structure space” by directed evolution

通过定向进化探索非自然“类胡萝卜素结构空间”

• 发表时间: 2018
• 作者: Yusuke Otani;Ling Li;Shifei Wang;Takuya Hosoi;Maiko Furubayashi; Saito Kyoichi;Shigeko Kawai-Noma; Daisuke Umeno
• 通讯作者: Daisuke Umeno

カロテノイド生合成経路の「進化能」の探索

探索类胡萝卜素生物合成途径的“进化潜力”

• 发表时间: 2017
• 作者: Saeki K;Tominaga M;Kawai-Noma S;Saito S;Umeno D;梅野太輔;梅野太輔;Daisuke Umeno;梅野太輔
• 通讯作者: 梅野太輔