スクアレン修飾酵素のスクリーニング法の開発と機能改良への応用

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トリテルペノイドはC30の分子骨格を持つイソプレノイドの総称であり，カロテノイド，ステロイド，という巨大な代謝物類のファミリーに加え，最近では，微細藻類などが合成するボトリオコッセンが加わり，その多様性の創出メカニズムに注目が集まっている。それぞれの生合成酵素の活性をスクリーニングする方法を開発し，それを用いて，それぞれの酵素の反応特異性を改良することが，本研究の最初の目的である。申請者は，ステロイド類の前駆体であるスクアレンを可視化する手法を開発した。本研究では，このスクリーニング法を用いて，様々なテルペノイド合成酵素の機能を改良することを目指した。昨年度までは，スクアレン合成酵素の近縁であるボトリオコッセン合成酵素（SSL1，SSL3）の細胞内活性の向上およびサイズ特異性改変を行い，C35,C40,C45非天然ボトリオコッセンの生合成を世界で初めて成功させることができた。さらに，反応ポケットに30個のアミノ酸置換を導入し，進化の過程でSSL3が失った前段の反応（2FPP→PSPP）を回復する変異体を得ることに成功した。また，スクアレン環化酵素(SHC )のスクリーニング系の構築に成功した。今年度は，スクアレン環化酵素(SHC )のスクリーニング系を用いて，中等度好熱好酸菌Alicyclobacillus acidocaldarius由来のスクアレン環化酵素(SHC)の37℃における大腸菌内活性が向上したSHC変異体を取得した。また，C35, C40, C50非天然スクアレン骨格を大腸菌内で選択的に生合成することができ，それそれの骨格合成経路にSHCを追加発現させることにより，C35, C40骨格の環化産物を大腸菌内生合成することができた。また，C35スクアレンの細胞内蓄積を可視化する経路を構築できた。