ＦＲＥＴ法を用いたマウス初期胚発生過程における高次クロマチン構造の動態解析

FRET法动态分析小鼠早期胚胎发育过程中的高阶染色质结构

• 批准号: 16J04146
• 负责人: 井上 弘貴
• 金额: $ 0.83万
• 依托单位: Institute of Physical and Chemical Research (2017)Tohoku University (2016)
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2016
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2016-04-22 至 2018-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-16J04146/
• 关键词: 核移植クローン; プロタミン; 高次クロマチン構造; FRET; 胚発生

FRET法の確立に関しては受精卵でのFRETシグナルの定量が困難であったため、今年度は主に、ヒストンに代わりDNAを折りたたむ役割を持つ精子核特異的タンパク質のプロタミンを強制発現させたドナー体細胞を用いることで、最終目的である体細胞核移植（somatic cell nuclear transfer: SCNT）技術の改善を目指した。まず、マウス卵丘細胞へのeGFP-2A-Prm1 mRNAトランスフェクションにより、eGFPタンパク質及びプロタミンタンパク質を強制発現（プロタミン化）させることに成功した。プロタミン化した卵丘細胞をドナー細胞として作出したプロタミン化SCNT胚は、通常の卵丘細胞をドナーとして用いたSCNT胚と比べ胚盤胞形成率が70 % 近くまで向上していた（通常は50 - 60 % 程度）が、プロタミン化SCNT胚の産仔率は向上しなかった。その理由としてプロタミンがDNA損傷を引き起こ可能性が考えられた。核移植胚のDNA損傷を調べるために我々は蛍光タグをつけたヒストンタンパク質を核移植胚で発現させ、プロタミン化SCNT胚におけるクロマチン動態を観察した。その結果、プロタミン化SCNT胚ではControl SCNT胚では見られない大きな核の断片化が引き起こされていることから、プロタミン化によりドナー体細胞の核がDNA損傷により切断されている可能性が示唆された。今後、DNA損傷を伴わないプロタミン化の条件を確立することでSCNT胚の発生効率の向上が期待できる。また、プロタミン化がSCNT胚に及ぼす影響を解析することで、精子核のプロタミンが胚発生に必要なリプログラミングに与える影響の解明への貢献が期待される。

The establishment of FRET method is related to the difficulty of quantification of FRET in fertilized eggs, and the improvement of somatic cell nuclear transfer (SCNT) technology is pointed out in this paper. The expression of eGFP-2A-Prm1 mRNA in cumulus cells was successfully induced by stress. The percentage of cumulus cells in SCNT embryos was 70% higher than that of blastoderm cells (usually 50 - 60%). The reason for this is that the DNA damage is caused by the presence of DNA. DNA damage in nuclear transfer embryos is modulated, and the development and dynamics of SCNT embryos are observed. As a result, the possibility of DNA damage in somatic cells by nuclear fragmentation was demonstrated by the presence of DNA fragments in SCNT embryos. In the future, the conditions for DNA damage and development will be established, and the growth rate of SCNT embryos will be expected to increase. The contribution of sperm nucleus to the analysis of the effects of embryo development and fertilization on SCNT is expected.