Elucidation of mechanical property and self-repair mechanism of microtubule with high-speed AFM

用高速原子力显微镜阐明微管的机械性能和自我修复机制

• 批准号: 17F17701
• 负责人: 内橋 貴之
• 金额: $ 1.47万
• 依托单位: Nagoya University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2017
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2017-04-26 至 2019-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-17F17701/
• 关键词: 微小管; 構造欠陥; 高速原子間力顕微鏡; ダイナミクス計測; 一分子計測; 一分子操作

I. インラインフォースカーブモードの開発：高速AFMでタンパク質の動態を可視化しながら、任意の位置で試料の力学操作と機械特性計測が可能なインラインフォースカーブモードを開発した。具体的には、イメージング中にPCに表示された画像で決めた位置で画像取得を停止し、プローブ-試料間距離を変化させてフォースカーブを取得し、引き続きイメージングを行い局所外力印加後の分子の動態を観察できるシステムを構築した。これにより微小管への局所外力の印加とそれによる構造変化やナノ力学特性の定量的解析が可能になった。II.　微小管への欠陥生成と機械特性評価：インラインフォースカーブモードを使って、微小管からチューブリンダイマーを引き抜き、同時にフォースカーブを計測することに成功した。さらに、欠陥のサイズを変えながらフォースカーブを取得し、チューブリン間の結合力を定量化した。これにより、これまで理論的にしか研究されていなかった微小管の機械特性を解析することができた。III. 微小管の自己修復過程の可視化：微小管にチューブリンダイマーの欠陥を形成後、その欠陥が再びチューブリンの再結合による修復される、自己修復と呼ばれる現象を捉えることに成功した。この測定により、微小管の自己修復過程は微小管の中空内で拡散しているチューブリンの結合で生じることを明らかにした。IV. 欠陥周囲のキネシンの運動解析：微小管の構造欠陥周辺でのキネシンの運動観察を行った。微小管に沿って進んできたキネシンが欠陥直前で微小管から解離したり、プロトフィラメントを乗り換えて、欠陥を迂回して進んでいく様子が見られた。さらに再現性の高い実験を可能にするため、多数の微小管を平行に並べてストライプ状に配列させる基板条件の検討を行った。その結果、適切なバッファ条件と基板に脂質二重膜を用いることで微小管をストライプ状に整列させることに成功した。

I. イ ン ラ イ ン フ ォ ー ス カ ー ブ モ ー ド の open 発 : high-speed AFM で タ ン パ ク qualitative の を dynamic visualization し な が ら mechanical operation, try any position の で の と mechanical properties measuring が may な イ ン ラ イ ン フ ォ ー ス カ ー ブ モ ー ド を open 発 し た. Specific に は, イ メ ー ジ ン グ に in PC に said さ れ た portrait で definitely め た location portraits で obtain を stop し, プ ロ ー ブ - the distance between the sample を variations change さ せ て フ ォ ー ス カ ー ブ を obtain し, lead き 続 き イ メ ー ジ ン グ を line い bureau after the Inca の molecular の dynamic force を 観 examine で き る シ ス テ ム を build し た. The quantitative analysis of the mechanical properties of the microtubule へ local external force <e:1> of the Inca とそれによる structural change やナノ may になった になった. II. The tiny tube へ の owe 陥 generated と mechanical properties evaluation 価 : イ ン ラ イ ン フ ォ ー ス カ ー ブ モ ー ド を make っ て, tiny tubes か ら チ ュ ー ブ リ ン ダ イ マ ー を lead き sorting き, at the same time に フ ォ ー ス カ ー ブ を measuring す る こ と に successful し た. さ ら に, owe 陥 の サ イ ズ を - え な が ら フ ォ ー ス カ ー ブ を obtain し, チ ュ ー ブ リ ン の binding force between を quantitative し た. こ れ に よ り, こ れ ま で theory に し か research さ れ て い な か っ た tiny tube の mechanical properties を parsing す る こ と が で き た. III. の oneself repair tiny tube の visualization: tiny tube に チ ュ ー ブ リ ン ダ イ マ ー の owe 陥 を, after the formation of そ の owe 陥 が again び チ ュ ー ブ リ ン の combining に よ る repair さ れ る, shout oneself repair と ば れ る phenomenon を catch え る こ と に successful し た. こ の determination に よ り は tiny, tiny tubes の their repair tube hollow の で within company, scattered し て い る チ ュ ー ブ リ ン の combining で raw じ る こ と を Ming ら か に し た. IV. Owe 陥 weeks 囲 の キ ネ シ ン の motion resolution: tiny tube の structure owe 陥 weeks 辺 で の キ ネ シ ン の line movement 観 examine を っ た. Small tube に along っ て in ん で き た キ ネ シ ン が owe 陥 ahead で tiny tube か ら dissociation し た り, プ ロ ト フ ィ ラ メ ン ト を 乗 り in え て, owe 陥 を circuitous し て in ん で い く others child が see ら れ た. さ ら に high reproducibility の い be 験 を may に す る た め, most の tiny tubes を parallel and に べ て ス ト ラ イ プ shape に match column さ せ る substrate conditions の 検 line for を っ た. そ の results, appropriate な バ ッ フ ァ conditions と substrate に double membrane lipid を with い る こ と で tiny tube を ス ト ラ イ プ shape に whole column さ せ る こ と に successful し た.

项目成果

Self-healing of microtubules studied by high-speed AFM

高速原子力显微镜研究微管的自我修复

• 发表时间: 2018
• 作者: Matsubayashi M;Inaoka DK;Komatsuya K;Hatta T;Kawahara F;Sakamoto K,Hikosaka K;Yamagishi J;Sasai K;Shiba T;Harada S;Tsuji N;Kita K.;Christian Ganser and Takayuki Uchihashi
• 通讯作者: Christian Ganser and Takayuki Uchihashi

Defects in Microtubules Studied by High-Speed Atomic Force Microscopy

通过高速原子力显微镜研究微管缺陷

• 发表时间: 2018
• 作者: Katagiri S;Iwasa M;Hayashi T;Hosono K;Yamashita T;Kuniyoshi K;Ueno S;Kondo M;Ueyama H;Ogita H;Shichida Y;Inagaki H;Kurahashi H;Kondo H;Ohji M;Hotta Y;Nakano T.;Christian Ganser and Takayuki Uchihashi
• 通讯作者: Christian Ganser and Takayuki Uchihashi

Microtubule defects, self-healing, and tubulin bond energies with high-speed AFM

高速 AFM 的微管缺陷、自修复和微管蛋白键能

• 发表时间: 2018
• 作者: Ebiloma Godwin U.;Ayuga Teresa Diaz;Balogun Emmanuel O.;Gil Lucia Abad;Donachie Anne;Kaiser Marcel;Herraiz Tomas;Inaoka Daniel K.;Shiba Tomoo;Harada Shigeharu;Kita Kiyoshi;de Koning Harry P.;Dardonville Christophe;Christian Ganser and Takayuki Uchihashi
• 通讯作者: Christian Ganser and Takayuki Uchihashi

Creating and analyzing microtubule defects with high-speed AFM

使用高速 AFM 创建和分析微管缺陷

• 发表时间: 2018
• 作者: Shimizu A;Zankov DP;Kurokawa-Seo M;Ogita H.;Christian Ganser and Takayuki Uchihashi
• 通讯作者: Christian Ganser and Takayuki Uchihashi

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