High-Speed-AFM Analysis of Structural and Mechanical Properties of Single Protein under Mechanical Stimulation

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前年度に開発した一軸伸張機構付き探針走査型高速AFMを用いて、脂質膜の曲率を感知して膜に結合する分子であるBIN1の曲率依存的な膜への結合を観察した。PDMS基板に応力を加えると、基板表面に応力印加方向とは垂直方向に沿って表面リップル構造を曲率を制御して作ることができた。次にBIN1の脂質膜への結合ダイナミクスを観察したところ、平坦な脂質膜へは明らかな結合は確認できなかった。親和性の高いCNM関連変異体K436Xであっても観察できず、BIN1と平板脂質との相互作用はAFM探針からの外乱で容易に解離するほど弱いか、少なくとも結合時間は最速0.1秒/フレームのイメージング速度を用いた高速FMの時間分解能よりはるかに短いことを示している。一方、曲率を持つ脂質膜表面では0.5秒/フレームのイメージング速度でも、BIN1の脂質膜への結合が明確に観察された。ほとんどのBIN1分子は、脂質で覆われたリップル構造の頂上付近で安定に結合し、側面や底面ではあまり結合しておらず、正の曲率領域への優先的な結合が示唆された。異なる曲率での単分子の脂質膜上での滞留時間のヒストグラムを作り、単指数減衰関数でフィッティングしたところ、脂質膜の曲率が5.59μm-1での時定数は1.83±0.09秒、414.27μm-1での時定数は3.77±0.06秒となった。これは、脂質曲率の違いにより親和性に2倍近い差が生じることを示している。これまでの研究では、BIN1と脂質の相互作用は、脂質の曲率の違いによるBIN1の結合による蛍光強度の変化としてしか解析できなかったが、今回開発した一軸伸張機構付き探針走査型高速AFMにより、脂質の曲率に依存した結合・解離のダイナミクスを1分子レベルで直接測定することができるようになった。