High-Speed-AFM Analysis of Structural and Mechanical Properties of Single Protein under Mechanical Stimulation

机械刺激下单一蛋白质的结构和机械特性的高速 AFM 分析

• 批准号: 21H01772
• 负责人: 内橋 貴之
• 金额: $ 11.15万
• 依托单位: Nagoya University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
• 财政年份: 2021
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2021-04-01 至 2024-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-21H01772/
• 关键词: 高速原子間力顕微鏡; タンパク質; 一分子; 一分子計測; 脂質膜; 応力印加; BIN1; 力学負荷; ダイナミクス; 微小管; キネシン; 動態解析; 機械ストレス; 一軸伸長機構

前年度に開発した一軸伸張機構付き探針走査型高速AFMを用いて、脂質膜の曲率を感知して膜に結合する分子であるBIN1の曲率依存的な膜への結合を観察した。PDMS基板に応力を加えると、基板表面に応力印加方向とは垂直方向に沿って表面リップル構造を曲率を制御して作ることができた。次にBIN1の脂質膜への結合ダイナミクスを観察したところ、平坦な脂質膜へは明らかな結合は確認できなかった。親和性の高いCNM関連変異体K436Xであっても観察できず、BIN1と平板脂質との相互作用はAFM探針からの外乱で容易に解離するほど弱いか、少なくとも結合時間は最速0.1秒/フレームのイメージング速度を用いた高速FMの時間分解能よりはるかに短いことを示している。一方、曲率を持つ脂質膜表面では0.5秒/フレームのイメージング速度でも、BIN1の脂質膜への結合が明確に観察された。ほとんどのBIN1分子は、脂質で覆われたリップル構造の頂上付近で安定に結合し、側面や底面ではあまり結合しておらず、正の曲率領域への優先的な結合が示唆された。異なる曲率での単分子の脂質膜上での滞留時間のヒストグラムを作り、単指数減衰関数でフィッティングしたところ、脂質膜の曲率が5.59μm-1での時定数は1.83±0.09秒、414.27μm-1での時定数は3.77±0.06秒となった。これは、脂質曲率の違いにより親和性に2倍近い差が生じることを示している。これまでの研究では、BIN1と脂質の相互作用は、脂質の曲率の違いによるBIN1の結合による蛍光強度の変化としてしか解析できなかったが、今回開発した一軸伸張機構付き探針走査型高速AFMにより、脂質の曲率に依存した結合・解離のダイナミクスを1分子レベルで直接測定することができるようになった。

Before the annual に open 発 し た one axis stretching institutions pay き probe walkthrough type high-speed AFM を with い て, lipid membrane の curvature を perception し て membrane に combining す る molecular で あ る BIN1 の curvature dependent な membrane へ の combining を 観 examine し た. PDMS substrate に 応 を え / る と, substrate surface に 応 force direction of the Inca と に は vertical direction along the っ て surface リ ッ プ を ル structure curvature を suppression し て as る こ と が で き た. Time に BIN1 の lipid membrane へ の combining ダ イ ナ ミ ク ス を 観 examine し た と こ ろ, flat な lipid membrane へ は Ming ら か な combining は confirm で き な か っ た. High affinity の い CNM masato even - variant K436X で あ っ て も 観 examine で き ず, BIN1 と tablet lipid と の interaction は AFM probe か ら の outside disorderly で す に dissociation easily る ほ ど weak い か, less な く と も combining time は the speed of 0.1 seconds / フ レ ー ム の イ メ ー ジ ン を グ speed with い た high-speed FM の time can decompose よ り は る か に Short とを とを とを indicates て て る る. One party, curvature を つ lipid membrane surface で は 0.5 seconds / フ レ ー ム の イ メ ー ジ ン グ speed で も, BIN1 の lipid membrane へ の combination が clear に 観 examine さ れ た. Molecular は ほ と ん ど の BIN1, lipid で わ れ た リ ッ プ ル structure on the top of the の paying nearly で settle に し, lateral や underside で は あ ま り combining し て お ら ず, curvature is の へ の priority な combined が in stopping さ れ た. Different な る curvature で の 単 molecular の lipid membrane で の residence time の ヒ ス ト グ ラ ム を り, damping 単 index number of masato で フ ィ ッ テ ィ ン グ し た と こ ろ, lipid membrane の curvature が 5.59 mu m - 1 で の when destiny は 1.83 + / - 0.09 seconds, 414.27 mu m - 1 で の destiny は 3.77 + / - 0.06 seconds when と な っ た. <s:1> れ れ, and lipid curvature <s:1> によ, the affinity に is nearly twice that of <s:1>, and the が difference in が and じる とを とを show that て and る る る る る る る. こ れ ま で の research で は, BIN1 と lipid の は interaction, lipids の curvature の violations い に よ る BIN1 の combining に よ る 蛍 light intensity の variations change と し て し か parsing で き な か っ た が, today back to 発 し た one axis stretching institutions pay き probe walkthrough type high-speed AFM に よ り, lipid の に curvature dependent し た combination, dissociation の ダ イ ナ ミ ク ス を 1 minute The レベ で で directly determines the する する とがで るようになった るようになった るようになった るようになった るようになった.

项目成果

高速原子間力顕微鏡の最近の応用展開と機能拡張

高速原子力显微镜的最新应用发展和功能扩展

• 发表时间: 2023
• 作者: N. Kikuchi;K. Sato;T. SHimatsu;O. Kitakami;S. Okamoto;Y. Akiyama;内橋 貴之
• 通讯作者: 内橋 貴之

Tip-scan high-speed atomic force microscopy with a uniaxial substrate stretching device for studying dynamics of biomolecules under mechanical stress

• DOI: 10.1063/5.0111017
• 发表时间: 2022-11-01
• 期刊: REVIEW OF SCIENTIFIC INSTRUMENTS
• 影响因子: 1.6
• 作者: Chan，Feng-Yueh;Kurosaki，Ryo;Uchihashi，Takayuki
• 通讯作者: Uchihashi，Takayuki

高速原子間力顕微鏡の分子ダイナミクス計測への応用と機能拡張

高速原子力显微镜在分子动力学测量中的应用和功能扩展

• 发表时间: 2023
• 作者: Y. Takahashi;T. Naito;and H. Fujishiro;内橋 貴之
• 通讯作者: 内橋 貴之

"Microtubule Preparation for Investigation with High-Speed Atomic Force Microscopy": PART V: Analysis of Microtubule Dynamics and Structures, 22 in Microtubules : Methods and Protocols (Methods in Molecular Biology) (Hiroshi Inaba Ed.)

“用于高速原子力显微镜研究的微管制备”：第五部分：微管动力学和结构的分析，微管中的 22：方法和方案（分子生物学方法）（Hiroshi Inaba 编辑）

• 发表时间: 2022
• 作者: Minami Tsuyoshi;Tang Wei;Asano Koichiro;Christian Ganser and Takayuki Uchihashi
• 通讯作者: Christian Ganser and Takayuki Uchihashi

"Single-Molecule Methods Applied to Circadian Proteins with Special Emphasis on Atomic Force Microscopy": pp. 147-178 in Circadian Rhythms in Bacteria and Microbiomes (C. H, Johnson and M. J. Rust Eds)

“单分子方法应用于昼夜节律蛋白质，特别强调原子力显微镜”：《细菌和微生物组昼夜节律》第 147-178 页（C. H、Johnson 和 M. J. Rust 编辑）

• 发表时间: 2021
• 作者: Peiyang Cai;Toru Akiyama;Tomomasa Kiyozawa;Takafumi Hatano;Shunta Harada;Miho Tagawa;Hiroshi Ikuta;Toru Ujihara (蔡 沛陽、秋山 亨、清澤 知正、畑野 敬史、原田 俊太、田川 美穂、生田 博志、宇治原 徹);Y. Takahashi;法橋陽，三澤賢明，高良明英，島村孝平，下條冬樹;Tetsuya Mori and Takayuki Uchihashi
• 通讯作者: Tetsuya Mori and Takayuki Uchihashi