染色体自身が制御する分裂期の分子機構と、その機能破綻による疾患誘導機序の解明

阐明染色体本身控制的有丝分裂期的分子机制及其功能障碍诱发疾病的机制

基本信息

批准号：
16K21749
负责人：
横山英樹
金额：
$ 36.03万
依托单位：
Ibaraki National College of Technology (2018, 2020-2022)ID Pharma (2019)
依托单位国家：
日本
项目类别：
Fund for the Promotion of Joint International Research (Home-Returning Researcher Development Research)
财政年份：
2018
资助国家：
日本
起止时间：
2018-04-01 至 2024-03-31
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-16K21749/
关键词：
細胞骨格・運動分裂期紡錘体染色体分配疾患誘導機序

项目摘要

細胞分裂に関与しうる蛋白質群を独自に同定し、それらの機能解析により紡錘体形成機構をはじめ分裂の未知の制御機構を解明している。昨年度、18の同定蛋白質をRNA干渉法によりヒト細胞からそれぞれノックダウンし、顕著な異常を示すものを選抜した。本年度はノックダウンにより紡錘体の多極化が誘導されるPABPN1、分裂期細胞数が異常に増加するNOC4Lについて解析を進めた。PABPN1 (poly A-binding protein nuclear 1)はmRNA前駆体のポリアデニル化に関わることが知られているが、紡錘体形成への関与の報告はない。高品質のヒトPABPN1抗体を得られなかったため、組換えPABPN1(Xenopus laevis)を発現、それを抗原としてウサギでXenopus PABPN1抗体を作製した。抗体を固定したビーズを用いて、カエル卵抽出液から内在性のPABPN1を効率よく除去することができた。この卵抽出液を用いて紡錘体形成の再構成反応を行ったところ、PABPN1がないと分裂期に染色体の周りに十分な微小管が重合せず、紡錘体も形成されなかった（中村ら、学会発表）。つまり、ヒトやカエルにおいてPABPN1は紡錘体形成に必須なことを明らかにできた。NOC4L(Nucleolar complex 4-like) はリボソームの生合成に関わることが知られているが、細胞分裂への関与の報告はない。我々は、NOC4Lノックダウンが分裂期細胞の増加だけでなく、紡錘体の多極化も引き起こすことを明らかにした（小川ら、学会発表）。また市販のヒトNOC4L抗体を用いてHeLa細胞を染色し、NOC4Lが紡錘体の両極に局在するのを見出した。さらにノックダウンによる異常は、ノックダウン耐性のNOC4Lを発現させると回復できた。つまり、NOC4Lは紡錘体極に局在して紡錘体の多極化を防ぐことで、細胞分裂の進行に貢献しているという結論に至った。

可以参与细胞分裂的蛋白质组已被独立鉴定，并通过对这些分裂的未知调节机制（包括纺锤体形成机制）的功能分析。去年，通过RNA干涉法将18种鉴定出的蛋白质从人类细胞中击落，并选择了表现出明显异常的蛋白质。今年，我们分析了PABPN1，该PABPN1诱导了由于敲低而引起的纺锤体的成极化，而NOC4L则异常增加有丝分裂细胞的数量。已知PABPN1（聚A结合蛋白核1）与mRNA前体的聚腺苷酸化有关，但没有报道其参与纺锤体形成。由于未获得高质量的人PABPN1抗体，因此表达了重组PABPN1（Xenopus laevis），并在兔子中以这种抗原为抗原在兔子中制备Xenopus pabpn1抗体。抗体固定珠用于从青蛙蛋提取物中有效去除内源性PABPN1。当卵提取物用于重建纺锤体形成时，在没有PABPN1的情况下，在有丝分裂阶段不允许足够的微管在染色体周围聚合，并且没有形成纺锤体（Nakamura等人，会议的呈现）。换句话说，据透露，PABPN1对于人类和青蛙的主轴形成至关重要。已知NOC4L（核仁复合物4样）参与核糖体生物合成，但没有关于其参与细胞分裂的报道。我们已经表明，NOC4L敲低不仅增加有丝分裂细胞，而且会使纺锤体增长（Ogawa等人，会议中的演示）。 HeLa细胞还使用市售的人NOC4L抗体染色，发现NOC4L位于纺锤体的两个杆子上。此外，可以通过表达抗敲低的NOC4L来恢复击倒引起的异常。换句话说，我们得出的结论是，NOC4L定位于纺锤极并防止纺锤体成极化，从而有助于细胞分裂的进展。