細胞内Ｈｓｐ９０のＦＲＥＴ型バイオセンサーの構築とその阻害剤探索への応用

细胞内Hsp90 FRET型生物传感器的构建及其在抑制剂寻找中的应用

• 批准号: 18J14502
• 负责人: 上田 毅
• 金额: $ 1.34万
• 依托单位: Kyoto University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2018
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2018-04-25 至 2020-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-18J14502/
• 关键词: タンパク質; ケミカルラベル; 薬剤スクリーニング; 生細胞; Hsp90; 不可逆阻害剤

Heat shock protein 90 (Hsp90) はATP依存的な分子シャペロンであり、細胞内において様々な蛋白質のフォールディングを制御している。このHsp90のシャペロン活性は、特にがん細胞の増殖や生存に関わる変異型がん遺伝子産物の安定化に必要不可欠である。その一方、正常蛋白質のHsp90への依存性は低いため、Hsp90はがん治療の新たな創薬標的として有望視されている。Hsp90の構造や活性は細胞内環境に大きく影響を受けるため、より正確なHsp90阻害剤評価のためには、本来のHsp90複合体状態を反映する生細胞での評価が重要である。一方、従来の生細胞での阻害剤評価は、がん関連蛋白質の分解を指標に行われており、Hsp90に対する結合活性や様式を直接検出する評価系は存在しないのが現状である。そこでまず、リガンド指向性NASA化学によるHsp90ラベル化の競合阻害実験を用いて、細胞内で既知のHsp90阻害剤の結合活性を評価できるか検討した。その結果、PU-H71、Geldanamycin、Ganetespib、BIIB021の阻害剤濃度依存的にラベル化の阻害が確認でき、EC50値を指標にHsp90阻害剤の結合活性を評価することが可能であった。一方、親和性の低いPU-WS13やアロステリック阻害剤であるGeduninではラベル化の阻害が見られなかったことから、本手法はHsp90のN末ATP結合サイトに高い親和性で結合する化合物を特異的に検出できることが明らかとなった。さらに本手法を薬剤スクリーニングに適用すると、1280個の化合物を含むライブラリーからHsp90に結合する化合物を新たに見出すことに成功した。この結果から、リガンド指向性NASA化学によるタンパク質修飾が新しい阻害剤を探索する戦略として有用であることが示された。

Heat shock protein 90 (Hsp90) は な molecules of ATP dependent シ ャ ペ ロ ン で あ り, intracellular に お い て others 々 な protein の フ ォ ー ル デ ィ ン グ を suppression し て い る. こ の Hsp90 の シ ャ ペ ロ ン は, active に が ん cells の や survival rights colonization に masato わ る - alien が ん heritage 伝 zi chan content の stabilization に need not owe で あ る. そ の side, normal protein の Hsp90 へ の low dependence は い た め, Hsp90 は が ん treatment の new た な gen 薬 mark と し て is expected to see さ れ て い る. Hsp90 の tectonic activity や は intracellular environment に big き く を by け る た め, よ り right な Hsp90 resistance against tonic review 価 の た め に は, originally の Hsp90 complex を reflect す る living cells で の review 価 が important で あ る. One party, the 従 の living cells で の resistance against tonic review 価 は, が ん masato even protein decomposition を の index line に わ れ て お り, Hsp90 に す seaborne る binding activity や を 検 directly from the others in type す る review 価 department は exist し な い の が status quo で あ る. そ こ で ま ず, リ ガ ン ド directivity NASA chemical に よ る Hsp90 ラ ベ ル change の co-opetition resistance against be 験 を with い て, intracellular で know の Hsp90 resistance against tonic の binding activity を review 価 で き る か beg し 検 た. そ の results, PU - H71, Geldanamycin, Ganetespib, BIIB021 の resistance against tonic concentration dependent に ラ ベ ル change の resistance against が confirm で き, EC50 numerical を index に Hsp90 resistance against tonic の binding activity を review 価 す る こ と が may で あ っ た. Side, low affinity の い PU - WS13 や ア ロ ス テ リ ッ ク resistance against tonic で あ る Gedunin で は ラ ベ ル change の resistance against が see ら れ な か っ た こ と か ら, this technique は Hsp90 の N at the end of the ATP combining サ イ ト に い high affinity で combining す る compound を specific に 検 out で き る こ と が Ming ら か と な っ た. さ ら に this gimmick を 薬 tonic ス ク リ ー ニ ン グ に applicable す る と, 1280 を の compounds containing む ラ イ ブ ラ リ ー か ら Hsp90 に combining す る compound を new た に shows す こ と に successful し た. こ の results か ら, リ ガ ン ド directivity NASA chemical に よ る タ ン パ ク qualitative modified が new し い resistance against tonic を explore す る 戦 slightly と し て useful で あ る こ と が shown さ れ た.

项目成果

細胞内の狙った天然タンパク質を迅速に化学修飾する分子技術を開発

开发分子技术以快速化学修饰细胞内的目标天然蛋白质

Covalent inhibition of protein-protein interaction (1): Development of covalent inhibitor based on N-acyl-N-alkyl sulfonamide (NASA) warhead

蛋白质-蛋白质相互作用的共价抑制（一）：基于N-酰基-N-烷基磺酰胺（NASA）弹头的共价抑制剂的开发

• 发表时间: 2019
• 作者: Tamura Tomonori;Ueda Tsuyoshi;Goto Taiki;Tsukidate Taku;Shapira Yonatan;Nishikawa Yuki;Fujisawa Alma;Hamachi Itaru;Tsuyoshi Ueda
• 通讯作者: Tsuyoshi Ueda

Development of a Cell-Based Ligand-Screening System for Identifying Hsp90 Inhibitors

• DOI: 10.1021/acs.biochem.9b00781
• 发表时间: 2020-01-21
• 期刊: BIOCHEMISTRY
• 影响因子: 2.9
• 作者: Ueda, Tsuyoshi;Tamura, Tomonori;Hamachi, Itaru
• 通讯作者: Hamachi, Itaru