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プロテオミクス／ゲノミクススクリーニング法を用いたＳＡＭＤ９分子機構の解明

利用蛋白质组学/基因组学筛选方法阐明SAMD9分子机制

基本信息

批准号：
18J21048
负责人：
中尾佳奈子
金额：
$ 1.6万
依托单位：
Tohoku University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2018
资助国家：
日本
起止时间：
2018-04-25 至 2021-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

今年度は、プロテオミクススクリーニングの新たな取り組みとして、近接性ラベリング解析により、SAMD9の相互作用分子の同定を試みた。まずSAMD9のＣ端にTurboIDを融合させたタンパク質をドキシサイクリン誘導性に安定発現するHEK293細胞を作製した。SAMD9は野生型のほか、複数家系のMIRAGE症候群患者で同定したR459Q変異を作製した。コントロールには核外搬出シグナル（NES）とTurboIDの融合タンパク質を使用した。3種の細胞株をビオチン0.5 mMを含む培地で1.5時間培養したのち、RIPAバッファーでライセートを調整した。その後、ストレプトアビジンビーズを用いてビオチン化タンパク質を捕捉し、Q-Exactive HFによる定量的プロテオミクス解析に供した。なお、実験手技に伴うばらつきを評価するため、野生型SAMD9とNESはduplicateで行った。得られた解析データから低カウント分子を除外したのち、まずduplicate間での相関を評価したところ、極めて良好な相関を示した。次に、野生型とNLSおよび野生型SAMD9と変異体SAMD9間での比較をGene Ontology解析およびネットワーク解析で行った。その結果、いくつかSAMD9の機能に関連する可能性がある分子が同定された。その一方で、SAMD9は細胞質に局在するタンパク質であるにも関わらず、野生型SAMD9の近傍分子として核内タンパク質がエンリッチされていおり、偽陽性と考えられた。原因として、ライセートの調整中に核内から出てきた核内タンパク質にTurboIDがビオチンを付加してしまっている可能性が疑われた。現在、この問題点に対処するため、細胞質画分だけを抽出することで、ライセート中での核内タンパク質との接触を避け、再実験を行う方向で準備を進めている。

For the current year, we need to learn more about the system, proximity analysis, and SAMD9 interacting molecules. The C-terminal of SAMD9, TurboID, fusion, fusion, fusion and fusion. The patients with MIRAGE syndrome of SAMD9 wild type and several pedigrees were diagnosed with R459Q. Please move out of the core (NES), TurboID, merge, merge, use, etc. (3) the cell strain was 0.5 mM, including the incubation time of 1.5 hours, and that of RIPA cells was adjusted. After that, you can analyze the supply by using the quantitative analysis method, such as capture, Q-Exactive HF, and so on. The wild type SAMD9, NES the duplicate, and the wild type. It is necessary to analyze the molecules except for the molecules, duplicate the molecules, the good ones and the good ones. Second, wild-type NLS, wild-type SAMD9, wild-type SAMD9, Gene Ontology analysis, row analysis. The results show that the SAMD9 mechanism is capable of determining the possibility of failure and the molecular weight is the same as the one. One side, one SAMD9 cell, the other, wild type SAMD9, wild type, wild type. The reason for this is that there is no doubt about the possibility that there is a doubt in the cause of the problem. The reason is that the reason is that there is a problem in the TurboID. At present, you need to make sure that you are not in contact with each other, and that you are ready to make contact with each other in the nuclear area.