プロテオミクス／ゲノミクススクリーニング法を用いたＳＡＭＤ９分子機構の解明

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今年度は、プロテオミクススクリーニングの新たな取り組みとして、近接性ラベリング解析により、SAMD9の相互作用分子の同定を試みた。まずSAMD9のＣ端にTurboIDを融合させたタンパク質をドキシサイクリン誘導性に安定発現するHEK293細胞を作製した。SAMD9は野生型のほか、複数家系のMIRAGE症候群患者で同定したR459Q変異を作製した。コントロールには核外搬出シグナル（NES）とTurboIDの融合タンパク質を使用した。3種の細胞株をビオチン0.5 mMを含む培地で1.5時間培養したのち、RIPAバッファーでライセートを調整した。その後、ストレプトアビジンビーズを用いてビオチン化タンパク質を捕捉し、Q-Exactive HFによる定量的プロテオミクス解析に供した。なお、実験手技に伴うばらつきを評価するため、野生型SAMD9とNESはduplicateで行った。得られた解析データから低カウント分子を除外したのち、まずduplicate間での相関を評価したところ、極めて良好な相関を示した。次に、野生型とNLSおよび野生型SAMD9と変異体SAMD9間での比較をGene Ontology解析およびネットワーク解析で行った。その結果、いくつかSAMD9の機能に関連する可能性がある分子が同定された。その一方で、SAMD9は細胞質に局在するタンパク質であるにも関わらず、野生型SAMD9の近傍分子として核内タンパク質がエンリッチされていおり、偽陽性と考えられた。原因として、ライセートの調整中に核内から出てきた核内タンパク質にTurboIDがビオチンを付加してしまっている可能性が疑われた。現在、この問題点に対処するため、細胞質画分だけを抽出することで、ライセート中での核内タンパク質との接触を避け、再実験を行う方向で準備を進めている。