生体触媒の誤作動を利用した不斉酸化反応の制御

利用生物催化剂故障控制不对称氧化反应

• 批准号: 18J23340
• 负责人: 鈴木 和人
• 金额: $ 1.98万
• 依托单位: Nagoya University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2018
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2018-04-25 至 2021-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-18J23340/
• 关键词: バイオ触媒; シトクロムP450; 酸化反応; 疑似基質; 立体選択性制御; 補因子置換; 結晶構造解析; シクロプロパン化反応; 部位特異的変異導入

巨大菌から単離されたP450BM3は、脂肪酸を非常に高速に水酸化するため、酸化触媒としての応用が期待されている。しかし、その高い基質特異性により、脂肪酸以外の有機化合物に対する酸化活性は非常に低く、応用面に課題を残していた。我々の研究室では、脂肪酸の構造に類似したカルボン酸類を「疑似基質」としてP450BM3に添加すると、P450BM3が誤作動し、その触媒サイクルを開始することを見出した。この「誤作動状態」にあるP450BM3に、ベンゼンやプロパンなどの非天然基質を加えると、それらの化合物の水酸化反応が進行することをこれまでに報告している。本申請課題では、この「疑似基質」によるP450BM3の誤作動状態を「疑似基質」の化学構造によって制御し、不斉反応の立体選択性を制御することを目的として研究を開始した。最終年度に実施した研究では、「疑似基質」が不斉反応を制御する様子を可視的に観測するため、合成ポルフィリン錯体を酸化活性種ミミックとして再構成し、さらに基質分子と「疑似基質」を複合化した、人工P450BM3の結晶構造解析を試みた。モデル基質としてスチレンを利用して共結晶化を行うと、実際の反応（スチレンのエポキシ化）の立体選択性と一致する向きで、スチレンが酵素内部に結合することを明らかとした。変異体P450BM3を利用した場合においても、反応のR/S選択性と、構造中のスチレンの向きから予測される選択性は一致していた。これらの結果から、本研究で調製した人工P450BM3は、実際の触媒サイクル中における反応環境を良く再現しているものと推測できる。つまり、得られた結晶構造は、捉えることが非常に困難な、P450BM3の反応が進行する「直前」の構造に極めて近いと予想され、P450BM3による酸化反応の機構解明や、「疑似基質」の動作機構の考察に大きく貢献するものと期待される。

P450BM3从巨大细菌羟基分离的P450BM3以极高的速度脂肪酸，预计将用作氧化催化剂。但是，由于其较高的底物特异性，其针对脂肪酸以外的有机化合物的氧化活性非常低，因此在其应用中留下了挑战。在我们的实验室中，我们发现将类似于脂肪酸与P450BM3的结构相似的羧酸作为“伪底物”会导致P450BM3导致故障并启动催化循环。据报道，当在这种“故障状态”中，将非天然底物（例如苯和丙烷）添加到P450BM3中时，这些化合物的羟基化反应会进展。在此应用中，研究始于控制这种“伪基板”的化学结构并控制不对称反应的立体选择性，以控制由这种“伪底物”引起的P450BM3的故障状态。在最后一年，为了视觉观察控制不对称反应的伪底物的状态，我们试图分析人造P450BM3的晶体结构，该p450bm3的晶体结构被重新组建为模拟的氧化活性物种，并进一步与Pseudo substrate结合了底物分子。据表明，使用苯乙烯作为模型底物的共结晶允许苯乙烯以与实际反应的立体选择性（苯乙烯的环氧化）一致的方向结合到酶内部。即使使用突变体P450BM3，反应的R/S选择性和从结构中苯乙烯方向预测的选择性也一致。从这些结果中可以估计，本研究中制备的人工P450BM3是对实际催化循环中反应环境的良好再现。换句话说，预期所得的晶体结构将非常接近“恰好在”结构的“ p450bm3反应前进”的“前”结构，这是极难掌握的，并且有望极大地促进P450BM3氧化反应的机制，并考虑“ PSEUDO substrate”的操作机制。

项目成果

Development of Stereoselective Oxidation System Catalyzed by Cytochrome P450BM3 Using Decoy Molecules

利用诱饵分子开发细胞色素 P450BM3 催化的立体选择性氧化系统

• 发表时间: 2018
• 作者: K. Suzuki;O. Shoji;J. K. Stanfield;S. Yanagisawa;H. Sugimoto;Y. Shiro;Y. Watanabe
• 通讯作者: Y. Watanabe