Creation of caged peptides possible for dissociation from target and switching target upon photo-irradiation

创建笼状肽，可在光照射下从靶标解离并切换靶标

• 批准号: 22K05348
• 负责人: 渡邉 貴嘉
• 金额: $ 2.75万
• 依托单位: Japan Advanced Institute of Science and Technology
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• 财政年份: 2022
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2022-04-01 至 2025-03-31
• 项目状态: 未结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-22K05348/
• 关键词: ペプチド; ケージド化合物; 非天然アミノ酸; 進化分子工学; SELEX

本研究では、光照射によって標的分子から解離する「OFF型ケージドペプチド」および光照射によって標的分子から解離したペプチドが別の標的分子に結合するようになる「標的スイッチ型ケージドペプチド」の創製を目指して研究を進めている。令和4年度は、まず複数のケージドアミノ酸誘導体を化学合成し、質量分析によって合成を確認した。次に、アンバーサプレッション法を用いてケージドアミノ酸をペプチドに導入した。実際には、化学的アミノアシル化法でアンバーサプレッサーtRNAにケージドアミノ酸を結合させ、アンバーコドンを持つペプチド発現mRNAとともに無細胞翻訳系に加えることで、ケージドアミノ酸導入ペプチドを発現させた。発現させたペプチドの一部に365 nm光照射を行い、光照射前後のペプチドの質量分析を行ったところ、ケージドアミノ酸導入ペプチドの発現および光照射によるケージド基の脱離を確認した。続いて、ケージドアミノ酸を組み込んだペプチドライブラリを用いてケージドペプチドのセレクションが可能か評価した。具体的には、ランダムコドン配列を含むmRNAライブラリを作製し、ピューロマイシンリンカーをハイブリダイズさせた。そして、ケージドアミノ酸-tRNAとともに無細胞翻訳系に加えることで、ケージドペプチド-cDNA複合体ライブラリを作製した。その後、モデル実験として抗FLAG抗体に対するケージドペプチドのセレクションを行い、得られたペプチド-cDNA複合体の塩基配列を次世代シーケンサー（NGS）で解析したところ、FLAGペプチドのエピトープ領域にケージドアミノ酸が組み込まれたペプチド配列が有意に濃縮・回収された。このことから、今回構築したペプチドライブラリを用いてケージドペプチドのセレクションが可能であることを実証した。

In this study, the target molecules were dissociated by irradiation with light. The target molecules were dissociated by irradiation with light.たペプチドが比　　moleculeにcombinationするようになる　　　　　"ケケージドペプチド"のcreation project refers to the research and development of the project. Reiwa 4th year, chemical synthesis of the plural のケージドアミノ acid derivative, and mass analysis and synthesis confirmation.に、アンバーサプレッション法を Use いてケージドアミノ sour をペプチドに to import した. The chemical method of chemical chemical processingーtRNA にケージドアミノ acid を conjugation させ、アンバーコドンを志つペプチド発成mRNA とともに Cell-free Translation System にえることで、ケージドアミノAcid introduction ペプチドを発成させた.発行させたペプチドの一一に365 nm light irradiation を行い、Quality analysis of のペプチドのを行ったところ、ケージド before and after light irradiationアミノAcid introduction ペプチドの発appears およびLight irradiation によるケージドbase の出をconfirmation した.続いて、ケージドアミノ acid を group み込んだペプチドライブラリを用いてケージドペプチドのセレクションがpossibleか evaluation価した. The specific には, ランダムコドン arrangement をcontains むmRNA ライブラリをMade in Japanそして, ケージドアミノ acid-tRNA とともに cell-free translation system に加えることで, ケージドペプチド-cDNA complex ライブラリを manufactured by した.その后、モデル実験としてanti-FLAG antibody に対するケージドペプチドのセレクションを行い, 德られたペプチド-cDNA complex の塩组array を next generation シーNGS (NGS) analysis field, FLAG field The にケージドアミノ acid group み込まれたペプチド arrangement is intentionally concentrated and recycled.このことから、This time the construction of したペプチドライブラリを用いてケージドペプチドのセレクションがpossibleであることを実证した.