駆除対象草本植物の飼料化に適した白色腐朽菌の分子育種

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ヒラタケにおいて組換えにあたらない遺伝子改変系を開発を目指すため、CRISPR/Cas9発現カセット遺伝子の一時的導入による目的遺伝子の破壊を試みた。その結果、複数の目的遺伝子破壊株を得ることができ、それらの多くにCas9遺伝子が含まれていなかった。これにより、RNPとは異なり選択マーカー遺伝子によりゲノム編集株を素早く選抜できる非組換え遺伝子改変系の開発につながる技術の開発ができた。シイタケは我が国においてヒラタケ以上に有名な食用担子菌である。種村らによると植物由来飼料に対する高い性能改善効果が期待される（種村ら　Aquaculture 2016;453:130-134）。しかし、ヒラタケ以上に遺伝子工学的実験手法の開発が遅れており、遺伝子機能解析に必須である遺伝子ターゲティングの成功例も存在しない。ドナーベクターのみ用いたシイタケpyrG遺伝子の相同組換え（HR）による破壊を3回試行したところ22個/実験のカルボキシン耐性株を得ることができたが、HR体は含まれていなかった。これによりシイタケにおいても他の真正担子菌綱の菌類と同様にHRよりもNHEJが優先的に起こることが示された。次に、pyrG遺伝子を切断するように調製したCRISPR/Cas9カセットを持つCas9ベクターとの共導入実験を行った。3回の試行で36個/実験のカルボキシン耐性株を得ることができた。このうち7株についてはHRによるシイタケpyrG遺伝子の破壊が確認された。Cas9遺伝子配列のゲノムPCRを行ったところ、7株中5株については増幅が確認できなかった。得られたΔpyrG株を宿主としてシイタケpyrG遺伝子の導入を2回繰り返したところ、平均6個/実験の原栄養体を得ることができた。これにより新規選択マーカー遺伝子としてもシイタケpyrG遺伝子を利用できることが示された。